甘油四醚类化合物的高分辨质谱表征

李运运，何 晨，吴建勋，张亚和，梁咏梅，史 权,，张传伦

(1.中国石油大学(北京)重质油国家重点实验室，北京 102249；2.深圳海洋地球古菌组学重点实验室，南方科技大学海洋科学与工程系，广州 深圳 518055)

甘油二烷基甘油四醚(glycerol dialkyl glycerol tetraethers, GDGTs)作为古菌和细菌的大分子生物标志物，是两者细胞膜结构的重要组成，广泛分布于各类自然环境中[1]。GDGTs主要包括源自古菌的类异戊二烯型甘油二烷基甘油四醚类化合物(isoprenoid GDGTs, iso-GDGTs)和源自细菌的支链型甘油二烷基甘油四醚类化合物(branched GDGTs, br-GDGTs)，是由2条烷基侧链通过醚键与两端的甘油基团形成的环状大分子[2]，结构式示于图1。GDGTs的分子组成分布及分子结构变化对其源微生物生存环境变化响应敏感，包含丰富的古环境信息，已广泛应用于构建一系列GDGTs古环境替代指标[3]，如陆源输入指标(branched vs isoprenoid tetrether, BIT)用于重建土壤有机质输入[4]、基于86个碳原子四醚指数的古温度计指标(TetraEther indeX of 86 carbon atoms, TEX86)用于重建表层海水温度[5]、甲基化指数(methylation index of branched tetraethers, MBT)与环化指数(cyclisation ratio of branched tetraethers, CBT)之比(MBT/CBT)反映陆地年均大气温度以及土壤pH值变化[6]等。对GDGTs分子组成的全面详细表征，可为古环境指标提供更全面的基础数据支撑[7-11]。

GDGTs化合物相对分子质量较大，通常分布于1 000～1 400之间。古菌烷基的侧链类型以类异戊二烯烷烃为主，细菌烷基的侧链类型以支链型烷烃为主。环境对烷基侧链的修饰主要包括羟基化、环化、不饱和化及甲基化，导致不同GDGTs分子的烷基侧链结构复杂多样，这为GDGTs的分子组成分析和结构表征带来很大挑战。质谱分析方法已广泛应用于GDGTs的组成研究，如飞行时间质谱(time-of-flight-mass spectrometry, TOF-MS)、高温气相色谱-串联火焰离子化检测法/质谱法(high temperature gas chromatography-flame ionisation detection/mass spectrometry, HTGC-FID/MS)[12]以及高效液相色谱-串联大气压化学电离质谱法(high performance liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry, HPLC-APCI-MS)[2]等。HPLC-APCI-MS采用选择离子监测模式(selected ion monitoring mode, SIM)对已知GDGTs进行靶向分析，是生物地球化学研究应用最广泛的分析方法，极大推进了GDGTs在环境化学和地球化学领域的研究[13-15]。然而，该方法无法分析具有潜在地球化学意义的未知GDGTs分子，且在SIM模式应用过程中常使用四极杆质谱作为检测器，其低分辨检测能力会导致iso-GDGTs和br-GDGTs产生不同程度的离子强度损失，最高可达36%，严重影响了古环境指标的准确性[16]。此外，该方法的样品前处理过程繁琐、回收率不高，一些相对含量较低的GDGTs可能无法被检测[9,17]。鉴于GDGTs在地球化学和环境化学领域中的重要性日益显著，迫切需要一种高效、全面分析环境样品中GDGTs分子组成和分子结构信息的方法[18]。

注：a.iso-GDGTs；b.br-GDGTs图1 地质体中常见的GDGT类化合物结构示意图[9]Fig.1 Structures of GDGTs commonly found in geological environment

大气压光致电离正离子模式耦合傅里叶变换离子回旋共振质谱(atmospheric pressure photoionization in positive mode coupled to fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry, APPI-P FT-ICR MS)在GDGTs分子组成分析方面取得了一些新进展[19]。APPI电离源对GDGTs的电离效果较常用的APCI电离源更温和。使用APPI分析GDGTs时，溶剂甲苯促进质子转移反应和电荷交换，形成准分子离子[M+H]+，使其在GDGTs分子信息表征上具有巨大潜力。虽然FT-ICR MS已经成功应用于GDGTs分子组成表征，但高昂的仪器成本和维护费用大大限制了其广泛应用[19]。高分辨轨道离子阱质谱(Orbitrap MS)可提供约250 000(@m/z400)的分辨能力，能够满足鉴定海洋沉积物中GDGTs分子组成的要求；并且Orbitrap MS可与HPLC串联分析GDGTs，在地球化学领域具有重要的应用潜力。

本研究拟以海洋沉积物为研究对象，使用APPI-P Orbitrap MS分析GDGTs的组成与结构。基于Orbitrap MS的超高分辨能力，以获得准确的GDGTs分子组成和丰富的串联质谱碎片离子信息，从而实现对GDGTs分子组成和分子结构的高效全面表征。

1 实验部分

1.1 仪器与装置

Thermo Fisher Orbitrap FusionTMTribridTM高分辨质谱仪：美国Thermo Fisher公司产品，配有大气压光致电离源、Xcalibur 3.0工作站；电子分析天平(ME204E)：瑞士Mettler Toledo公司产品；TDL-5A台式离心机：亿能实验仪器厂产品；FD-1C-50真空冷冻干燥机：上海比朗仪器制造有限公司产品。将锥形瓶、移液瓶等玻璃仪器洗涤干净，放入烘箱内烘干，然后放入马弗炉内在500 ℃下烘烧5 h，除去有机、无机离子杂质。

1.2 试剂与样品

甲苯、二氯甲烷、甲醇，所用有机试剂均为LC-MS级，美国Thermo Fisher公司产品。

1.3 样品制备

沉积物样品为珠江口海底表层沉积物，采样地点为113° 43′ 21.25″ E、22° 38′ 5.07″ N，采样深度0～5 cm。冷冻保存的沉积物样品经冷冻干燥48 h，以除去其中水分，得到完全干燥的母样，将其置于玛瑙研钵中研磨30 min，称量约20 g研磨后的样品，放入滤纸袋中封好，置于索氏抽提管中。使用DCM-MeOH混合溶剂(9∶1，V/V)在55 ℃下回流抽提样品24 h，充分抽提出沉积物中的脂类化合物。抽提后的总脂过0.45 μm玻璃纤维滤膜，以除去其中的颗粒杂质，将溶剂旋蒸后，用甲苯复溶并置于-20 ℃冰箱中保存。

1.4 实验条件

大气压光致电离源，正离子模式；毛细管温度200 ℃；喷雾电压3 000 V；鞘气(N2)流速25 Arb；扫气(N2)流速2 Arb；辅助气(N2)流速5 Arb；离子输送管温度320 ℃；采用全扫描模式采集数据；质量扫描范围m/z1 000～1 600；二级质谱隔离宽度为1 u；高能碰撞解离(HCD)碰撞能量相对强度20%。

2 结果与分析

2.1 GDGTs分子组成分析

使用APPI-P Orbitrap MS检测到沉积物中GDGTs分子组成及分布范围信息，示于图2。沉积物抽提物APPI-P质谱图示于图2a，主要由分布于m/z1 000～1 100的br-GDGTs和分布于m/z1 250～1 350的iso-GDGTs组成，依据Orbitrap MS提供的精确质荷比，结合质子化分子离子及其同位素峰相对丰度，对图2a中的br-GDGTs和iso-GDGTs进行鉴定，共鉴定到14种GDGTs，分别为br-GDGT Ia、br-GDGT Ib、br-GDGT Ic、br-GDGT IIc、br-GDGT IIb、br-GDGT IIa、br-GDGT IIIb、br-GDGT IIIa、GDGT-0、GDGT-1、GDGT-2、GDGT-3、crenarchaeol和GDGT-6，列于表1，平均分辨率约15万，测量误差在±1×10-6之内。

图2 沉积物提取物br-GDGT Ib及其13C同位素准分子离子分布图Fig.2 Mass spectra of br-GDGT Ib and its 13C isotopologs in sediment extracts

表1 GDGTs分子组成信息Table 1 Molecular composition of GDGTs

续表1

m/z1 019.5～1 022.5的局部放大谱图示于图2b，br-GDGT Ib的实测质谱峰与理论同位素质谱峰的相对强度及分布对应良好。值得注意的是，br-GDGT Ib的同位素峰[13C2C64H130O6+H]+的理论相对分子质量为1 022.000 740 u，与br-GDGT Ia的[C66H132O6+H]+理论相对分子质量仅相差0.008 928 u。m/z1 021.85～1 022.15的局部放大谱图示于图2c，br-GDGT Ib的同位素分子离子峰与br-GDGT Ia的质子化分子离子峰成功分离，表明Orbitrap MS提供的超高质量分辨率可以满足GDGTs分子的直接分析需求。但实测的br-GDGT Ib同位素峰[13C2C64H130O6+H]+相对丰度低于理论同位素质谱峰，这可能是由于仪器调谐等因素导致的。

依据APPI-P Orbitrap MS出色的高分辨能力，实现了对沉积物中GDGTs分子精准的非靶向定性分析，可全面分析所有潜在的GDGTs分子，表征GDGTs分子组成分布及相对丰度信息。

2.2 串联质谱表征GDGTs分子结构

通过APPI-P Orbitrap MS/MS对crenarchaeol、GDGT-0和br-GDGT Ia这3类具有代表性结构的GDGTs类化合物在梯度碰撞能量下进行隔离碎裂检测，结果示于图3。GDGT-0和crenarchaeol源自古菌，均具有双植烷型侧链结构，区别在于前者烷基侧链上无环状结构，后者烷基侧链分别具有2和3个环结构。由图3可见，当HCD相对能量为0%，仅对离子实施隔离而不提供碰撞能量，成功实现了GDGTs的准分子离子峰的单独隔离检测；随着HCD相对能量增大至15%，母离子出现轻微碎裂，m/z600～800范围内出现碎片离子簇，为目标离子丢失18 u(H2O) 和74 u(C3H6O2)形成的碎片离子峰；当HCD相对能量为20%时，碎片离子相对强度超过母离子，观察到碎片离子的数目最全、种类最多；当HCD相对能量增大至25%，m/z600～800范围内的碎片离子簇进一步碎裂成为更小质量的碎片离子簇(

在APPI-P Orbitrap MS/MS检测模式下，化合物crenarchaeol、GDGT-0和br-GDGT Ia经不同的碎裂方式生成一系列碎片离子，三类GDGTs均产生脱H2O和脱C3H6O2的碎片离子峰，对应GDGTs分子结构中的羟基基团和甘油基团。每类GDGT分子在多级裂解过程中均产生多个系列的特征性碎片离子簇，br-GDGT Ia共检测到51种烃链碎片离子，44种含氧碎片离子；crenarchaeol共检测到36种烃链碎片离子，31种含氧碎片离子；GDGT-0共检测到34种烃链碎片离子，20种含氧碎片离子，主要碎片离子信息列于表2。

每个GDGT分子均有多种碎裂方式，通过对碎片离子进行强度筛选，将相对丰度较高的碎片离子的碎裂方式作为该GDGT分子的特征碎裂途径。以br-GDGT Ia为例，第一种途径A是[C66H132O6+H]+甘油基团的烷基侧链发生碎裂，形成[C33H64O2+H]+和[C33H68O4+H]+，示于图4a；另一种途径B是[C66H132O6+H]+的烷基侧链发生碎裂，形成[C30H56+H]+和[C36H74O6+H]+，并进一步以丢失H2O中性基团的方式失去含氧官能团，生成系列碎片离子。在GDGT-0的检测结果中，观察到相似的特征碎片离子簇，GDGT-0与br-GDGT Ia具有相似的分子平均结构，[C86H172O6+H]+经碎裂丢失烷基侧链[C40H72]形成[C40H72+H]+和[C46H94O6+H]+，另一种途径则是丢失[C43H84O2]形成[C43H88O4+H]+、[C43H84O2+H]+等含氧碎片离子，示于图4b。

图3 APPI-P Orbitrap MS/MS HCD模式下，crenarchaeol、GDGT-0与br-GDGT Ia串联质谱图随HCD相对能量变化Fig.3 Mass spectra of crenarchaeol, GDGT-0 and br-GDGT Ia with various of HCD energy in APPI-P Orbitrap MS/MS HCD mode

表2 GDGTs主要碎片离子信息Table 2 Dominant fragment ions of GDGTs

图4 br-GDGT Ia (a)、GDGT-0(b)和crenarchaeol(c)的APPI-P Orbitrap MS/MS质谱图和特征碎裂示意图Fig.4 Mass spectra and fragmentation pathways of br-GDGT Ia (a), GDGT-0 (b) and crenarchaeol (c) by APPI-P Orbitrap MS/MS

Crenarchaeol的分子结构与br-GDGT Ia、GDGT-0不同，分子中存在含环状结构的烷基侧链，且不同侧链所含环数不同，[C86H162O6+H]+以途径A、B 2种烷基侧链碎裂的方式可分别生成[C46H88O6+H]+和[C46H90O6+H]+2个系列的碎片离子簇，示于图4c。

使用APPI-P Orbitrap MS/MS对crenarchaeol、GDGT-0和br-GDGT Ia的分析结果表明，不同GDGT分子经串联质谱分析所获得的碎片离子簇的碳数-DBE分布图特征性地反映了其分子结构信息。以crenarchaeol为例，APPI-POrbitrap MS/MS质谱图提供的结构组成信息示于图5，其中低分子质量烷烃侧链碎片离子反映了GDGTs分子结构的烷烃侧链信息，在400～500 u范围内，含有3个环的烷烃侧链形成的碎片离子占主导地位，随着亚甲基断裂，单质量点上烷烃侧链碎片离子簇DBE分布情况并未发生变化；在200～400 u和100～200 u范围内，随着碎片离子相对质量减小，碎裂程度加深，烃链上的开环过程导致占主导地位的碎片离子DBE随分布区间下降。碎片离子的DBE碳数分布图示于图5c，其具有良好的规律性。图5b中这些由母离子在碰撞过程中形成了种类复杂、数量繁多的烃类碎片离子簇的DBE碳数分布对应图5c中左下角区域，较好地反映了目标GDGTs分子的烷烃侧链结构信息，故将其定义为指纹区碎片离子簇，作为使用串联质谱表征其母离子分子结构特征的指标之一；右上角为crenarchaeol母离子，中间部分为分布特征性较强的含氧碎片离子簇，其不同的DBE分布对应不同的碎裂行为，而相同DBE对应相对丰度之和则反映该类碎裂行为在整体过程中所占的比重，示于图5c。对于crenarchaeol，在碎裂过程中主要以4类碎裂形式为主，其中以生成DBE=5的碎裂形式为主要途径。将这些含氧碎片离子作为特征区碎片离子簇，可成为使用串联质谱表征其母离子结构特征的另一指标。

注：a.烷基侧链碎裂示意图；b.指纹区碎片离子簇分布；c.总碎片离子簇DBE碳数分布图图5 APPI-P Orbitrap MS/MS质谱图提供的crenarchaeol结构组成信息Fig.5 Gradient fragmentation spectra of crenarchaeol by APPI-P Orbitrap MS/MS

APPI-P Orbitrap MS不仅可以通过直接分析获得全面的GDGTs分子组成信息，而且Orbitrap MS具有精确质量隔离能力，可对目标GDGTs分子进行精确隔离碎裂检测，表征其分子结构信息。根据碎片离子簇的种类(是否含氧)和分布规律，将检测到的数百个碎片离子划分为指纹区碎片离子簇和特征区碎片离子簇，二者共同反映了GDGTs分子的烷烃侧链结构和含氧官能团等的结构信息。

需要注意的是，使用Orbitrap MS直接分析GDGTs无法获得单一GDGT分子的同分异构体，且串联质谱分析获得的是GDGT的平均分子结构信息，而非单一GDGT分子的结构信息。该方法可为鉴定GDGTs以及其他目前无法区分的异构体提供参考，并且可与高效液相色谱结合，在GDGTs总脂占比等定量分析方面具有重要潜力。

3 结论

本研究使用APPI-P Orbitrap MS直接分析海洋沉积物中古菌和细菌GDGTs化合物的分子组成，并研究了3种不同分子结构的GDGT在串联质谱正离子模式下的裂解行为。结果表明，从珠江口海底表层沉积物中检测到14种GDGTs。相较于传统的HPLC APCI-MS方法，Orbitrap MS提供的超高分辨率可在复杂基质中直接分析GDGTs化合物，从而缩短了分析时间，提高了分析效率，并且可通过一次分析全面获得GDGTs分子组成及分布，在鉴定新型GDGT同系物方面具有重要潜力。另外，对分子结构具有代表性的GDGT-0、crenarchaeol和br-GDGT Ia 3个化合物的二级质谱进行解析，结果表明，crenarchaeol的碎片离子簇比GDGT-0具有更特征性的碎裂方式和更丰富的指纹区烃链碎片离子簇，可以有效区分上述2种具有烷基侧链结构差异的同系物。通过解析串联质谱碎片离子簇，创新性地提出将二级质谱碎片离子分为特征区含氧碎片离子簇与指纹区烃链碎片离子簇，二者结合起来可作为GDGTs分子的“身份编码”，实现对GDGTs分子结构信息的快速表征，可完善GDGTs及其异构体信息，并为建立GDGTs分子信息库提供方法基础。APPI-P Orbitrap MS对快速鉴定新型GDGT具有重要潜力，但更重要的是，该方法有潜力作为快速识别GDGT及其同系物分子结构特征的工具，这些化合物组成分布可与古环境参数建立新的基于GDGT的环境替代指标。

致谢：感谢中国石油大学(北京)重质油国家重点实验室张未来、常伟峰等老师对本文所做的贡献。