吴茱萸致肝毒性部位在大鼠体内的多样性分析

孙向明，胡 扬，温 静，宋 辉，李文兰，丁振铎

(哈尔滨商业大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150076)

吴茱萸是传统的温里中药，用于散寒止痛，助阳止泻，降逆止呕。据文献[1-2]报道，其主要的化学成分为生物碱、苦味素、挥发油和黄酮等。现代药理研究表明[3-7]，吴茱萸主要活性成分具有抗肿瘤、抗菌、抗炎镇痛、保护胃黏膜、血管舒张、强心等作用。随着对吴茱萸药理作用和临床研究的不断深入，其肝毒性的相关研究受到广泛关注[8-11]。对于传统口服给药方式的中药，发挥作用的直接物质都存在于体内，受到胃肠道微生物、酸碱性、代谢酶等的影响，常会使其化学成分发生转化，体内不仅有原型成分，也可能存在代谢产物，这些物质都有可能是其发挥药效或毒性的物质基础。

在本课题组前期研究中，已经证实吴茱萸的50%乙醇提取物是致肝毒性部位[12]，并揭示了其在大鼠血清中的代谢情况[13]。然而，中药的体内代谢往往是多途径的，对中药成分的体内代谢行为进行多样性分析，有助于深入了解中药原型成分和代谢产物之间的质变代谢规律和体内作用过程。

本研究拟采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF MS)技术全面表征吴茱萸肝毒性部位经灌胃进入大鼠胆汁、尿液、粪便中的成分，通过分析大鼠体内运载的吴茱萸代谢产物信息，逆向追踪原型成分，推测各代谢产物可能的代谢途径。通过进一步比较原型成分及代谢产物在不同生物样品中的分布情况，以期全面分析吴茱萸在体内的代谢和排泄过程，为阐明肝毒性物质基础提供参考和佐证。

1 实验部分

1.1 仪器与装置

ACQUITY UPLC I-Class液相系统、Xevo G2-S QTOF质谱系统、UNIFI 1.7软件：美国Waters公司产品；Allegra 64R低温高速离心机：美国贝克曼库尔有限公司产品。

1.2 试剂与材料

吴茱萸：购自哈尔滨三棵树药材市场，经哈尔滨商业大学张德连教授鉴定为吴茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.) Benth.；ProElut PLS 固相萃取小柱(60 mg，3 mL)：北京迪科马科技有限公司产品；甲醇、乙腈和甲酸：色谱纯，美国赛默飞世尔科技有限公司产品。

雄性Wistar大鼠(合格证号SCXK-(吉))：质量为(230±20) g，购自长春国家生物产业基地实验动物中心。单次实验所用的大鼠均为同一批次，自由进食饮水，实验前适应性饲养1周。

1.3 灌胃药液的制备与给药

取适量吴茱萸粗粉，用50%乙醇浸泡过夜，热回流法提取2次，分别为8倍量溶剂提取120 min、7倍量溶剂提取90 min，将2次提取液减压浓缩至无醇味呈浸膏状，给药前以蒸馏水制成约1.4 g生药材/mL的灌胃药液。

将大鼠分为给药组和空白组，每组6只。给药前称取大鼠体重，按照35 g/(kg·d)(以生药计)的剂量灌胃给药，每天1次，空白组每天给予25 mL/kg蒸馏水，连续给药14天(本课题组的前期实验证实连续灌胃14天可致大鼠出现肝毒性[12])。

1.4 生物样品的采集和预处理

1.4.1生物样品的采集 于第13天给药后将大鼠放回代谢笼中，禁食不禁水，收集0～24 h内的尿液和粪便。末次给药后立即用10%水合氯醛对大鼠进行腹腔注射麻醉，打开腹腔，在十二指肠的肠系膜上找到具有韧性的白色胆管，用聚氯乙烯管向肝脏方向穿入，医用缝合线进行线结扎固定，收集4 h内流出的胆汁。整个实验过程中，用生理盐水纱布覆盖创面，并保持湿润。

1.4.2生物样品的预处理 分别取3 mL含药和空白胆汁样品，加入12 mL甲醇，于离心管中充分涡旋混匀1 min，再以12 000 r/min离心10 min，小心吸取上清液，氮气吹干。

将空白及含药尿液以3 000 r/min离心15 min，分别取3 mL离心后上清液活化平衡后的固相萃取小柱。先用蒸馏水淋洗，洗去强极性的杂质，弃去淋洗液；再分别用3 mL 50%甲醇、乙腈洗脱，收集、合并洗脱液，氮气吹干。

分别称取1 g捣碎后的含药和空白粪便样品，加入9 mL 0.01 mol/L磷酸盐缓冲液，做匀浆处理。再用水饱和正丁醇萃取3次，每次加入10 mL，收集萃出液，以3 000 r/min离心15 min，取上清液减压浓缩后，氮气吹干。在进行UPLC-Q-TOF MS分析前，用0.5 mL 50%甲醇充分溶解上述生物样品的氮吹残留物，经0.22 μm微孔滤膜除去杂质。

1.5 实验条件

色谱和质谱分析条件与参考文献[13]一致。采用HSS T3色谱柱(1.8 μm×100 mm×2.1 mm)；流动相：0.1%甲酸-水(A)，0.1%甲酸-乙腈(B)；梯度洗脱程序：0～0.3 min(1%B)，0.3～2 min(1%～15%B)，2～4 min(15%～25%B)，4～6 min(25%～55%B)，6～8 min(55%～70%B)，8～12 min(70%～99%B)；流速：0.5 mL/min。采用大气压电喷雾离子扫描；毛细管电压：2.5 kV；源温度：120 ℃；雾化气温度：500 ℃；雾化气流速：800 L/h；锥孔气流速：10 L/h；采集模式：MSE；采集质量范围：m/z50～1 200；低碰撞能量：4.0 eV；高碰撞能量：20.0～45.0 eV。

2 结果与讨论

2.1 大鼠胆汁、尿液和粪便中吴茱萸原型成分分析

采用UPLC-Q-TOF MS技术对灌胃吴茱萸肝毒性部位后的大鼠体内样品进行正、负离子模式扫描，比较样品的基峰离子(BPI)色谱图，结果表明，在正离子模式下信号响应更强，因此选取正离子模式进行分析。

空白胆汁与含药胆汁、空白尿液与含药尿液、空白粪便与含药粪便的BPI色谱图示于图1，共检测到10个排入胆汁的成分，20个进入尿液的成分，26个进入粪便的成分。进一步与吴茱萸肝毒性部位各化学成分的保留时间和质谱数据[13]比对，发现胆汁中4个成分为原型成分(1～4号峰)，尿液中15个成分为原型成分(2～16号峰)，粪便中22个成分为原型成分(1～5、7～23号峰)，结果列于表1。有关原型成分的解析过程已在文献[13]中做了详细阐述，本文不再赘述。

注：a～j峰为代谢产物峰，1～23为原型成分峰图1 含药胆汁与空白胆汁(a)，含药尿液与空白尿液(b)，含药粪便与和空白粪便(c)的基峰离子色谱图Fig.1 Base-peak ion chromatograms of medicated bile and blank bile (a), medicated urine and blank urine (b), medicated feces and blank feces (c)

2.2 大鼠胆汁、尿液和粪便中吴茱萸的代谢产物分析

由图1和表2可见，在胆汁中检测到6个代谢产物(a～f号峰)，在尿液中检测到5个代谢产物(a,c,e,g,h号峰)，在粪便中检测到4个代谢产物(b,c,i,j号峰)。其中，代谢产物b、c、e、h、j也是吴茱萸肝毒性部位在血中的代谢产物，分别对应喹诺酮类生物碱代谢物Ⅰ、羟基去氢吴茱萸碱、去甲基去氢吴茱萸碱、羟基吴茱萸碱和14-甲酰基二氢吴茱萸次碱[13]。由于代谢物b的结构未知，但其二级碎片离子m/z173.083 9、186.091 6是喹诺酮类生物碱的特征碎片离子[14]，提示其为喹诺酮类生物碱，但因缺乏相关文献报道，故在本文中将其暂定为

喹诺酮类生物碱代谢物Ⅰ。利用UNIFI 1.7软件数据库比对与人工解析相结合，进行质谱数据分析，参考化合物的裂解规律、各级质谱信息和已有文献报道对其他代谢物进行结构解析[15-20]：代谢物a的[M+H]+峰为m/z494.156 3，推断其分子式为C25H23N3O8，误差为0.01×10-6。碎片离子m/z318.124 2与母离子相差176.032 1 u，为母离子失去1分子葡萄糖醛酸(GlcA)产生的[M+H-C6H8O6]+，同时出现丢失葡萄糖醛酸苷(OGlcA)产生的m/z302.100 1碎片离子，因此推测代谢物a为去氢吴茱萸碱葡糖醛酸结合物。代谢物d的[M+H]+峰为m/z274.144 2，代谢物i的[M+H]+峰为m/z302.175 9，二者的碎片离子中都包含m/z173、186等喹诺酮类生物碱的特征碎片离子，由于结构未知，缺乏相关文献报道，分别暂定为喹诺酮类生物碱代谢物Ⅱ和喹诺酮类生物碱代谢物Ⅲ。代谢物f的[M+H]+峰为m/z520.339 8，有碎片离子m/z184.073 8、104.107 4，其结构未知。代谢物g的[M+H]+峰为m/z398.320 4，推断其分子式为C19H15N3O5S，误差为2.26×10-6，碎片离子m/z318.124 4与母离子相差80.195 7 u，为母离子丢失1分子磺酸基(SO3)产生的[M+H-SO3]+，碎片离子m/z302.129 1与母离子相差96.191 3 u，为母离子失去1分子硫酸基(SO4)形成的[M+H-SO4]+，推测g为去氢吴茱萸碱硫酸结合物。各代谢产物的二级质谱图示于图2。

2.3 代谢产物的代谢途径分析

本研究在大鼠的胆汁、尿液和粪便样品中共检测出10个代谢产物，其中4个代谢物结构未得到鉴定，6个代谢产物推测由4个原型成分通过葡萄糖醛酸结合、硫酸酯化、甲酰基化等Ⅱ相代谢以及羟基化、去甲基化等Ⅰ相代谢途径转化产生，具体的代谢途径示于图3[15-16,18]。推测代谢物a(去氢吴茱萸碱葡糖醛酸结合物)、代谢物c(羟基去氢吴茱萸碱)、代谢物e(去甲基去氢吴茱萸碱)、代谢物g(去氢吴茱萸碱硫酸结合物)分别是由原型成分去氢吴茱萸碱与体内葡萄糖醛酸结合、发生羟基化、脱甲基反应、与体内硫酸基发生结合反应产生的代谢产物；代谢物h(羟基吴茱萸碱)可能为羟基吴茱萸碱在体内发生羟基化的代谢产物；代谢物j(14-甲酰基二氢吴茱萸次碱)可能为二氢吴茱萸次碱在体内发生甲酰化后的代谢产物。

2.4 血清、胆汁、尿液、粪便中吴茱萸肝毒性部位的代谢比较

结合吴茱萸肝毒性部位入血成分分析结果[13]，比较吴茱萸肝毒性部位的原型成分和代谢产物在不同生物样品中的分布情况和代谢途径，有助于了解药物的体内作用过程和代谢规律。

注：a.去氢吴茱萸碱葡糖醛酸结合物；b.羟基去氢吴茱萸碱；c.去甲基去氢吴茱萸碱；d.去氢吴茱萸碱硫酸结合物；e.羟基吴茱萸碱；f.14-甲酰基二氢吴茱萸次碱图2 代谢产物的二级质谱图Fig.2 Secondary mass spectra of metabolites

图3 吴茱萸肝毒性部位在大鼠胆汁、尿液和粪便中的代谢途径Fig.3 Metabolic pathways of Euodiae Fructus hepatotoxic part in rat bile, urine and feces

吴茱萸的主要成分类型为生物碱类，极性较小，易以原型物形式被直接吸收。在大鼠体内共检测到23个吴茱萸肝毒性部位的原型成分，且多数成分的排泄途径呈多样性。就原型药物而言，肾排泄是主要消除途径，有些药物具有肝肠循环的特点，其代谢物经胆汁进入小肠，释放出原型药物，最终通过粪便排出。在血清中发现的15个原型成分会同时在尿液、胆汁或粪便中被检测到，推测这些原型成分经胃肠道被吸收入血后，通过肝门静脉进入肝脏，一部分进入体循环，最终随尿液排出体外，成为血清和尿液样品的共有成分，一部分被排泄到胆汁，经胆管到达小肠，直接由粪便排出，因此血清、胆汁、粪便中均能检出；一些成分未被完全吸收，则随肠道粪便排出，可在血清和粪便中同时检测到。另外，有7个原型成分未在血清中检测到，其中一个原因可能是由于药物含量甚微，现有的条件无法检测到，而尿液和粪便是累计收集24 h的样品，药物浓度一般高于血中，故在尿液和粪便中可以被检测到；另一个原因可能是该原型成分未被吸收入血，直接经肠道随粪便排出体外。

在大鼠的4种生物样品中共检测到12个代谢产物，其中4个成分结构未知。吴茱萸的代谢途径多样，在血清、尿液、粪便和胆汁中均能发现代谢产物，且Ⅰ相代谢和Ⅱ相代谢均会发生。去氢吴茱萸碱在大鼠体内发生了葡萄糖醛酸结合、硫酸酯化、羟基化和去甲基化等多种代谢反应，产生的代谢产物主要出现在胆汁和尿液样品中，可能以肝代谢为主，代谢产物极性增加，水溶性增强，主要排泄途径为肾和胆排泄。一般情况下，胆汁排泄是药物代谢物尤其是水溶性大的代谢物的主要排泄途径，分子质量<300的化合物从尿液排泄，分子质量300～500的化合物从胆汁和尿液排泄，分子质量大于500的化合物主要从胆汁排泄。此外，某些药物的胆汁排泄具有肝肠循环现象，胆汁分泌后又被小肠重新吸收，或者代谢物被分泌入胆汁，然后又在小肠转化为药物被重新吸收。在本研究中，以去氢吴茱萸碱葡糖醛酸结合物为例，分子质量为493，由表2可知，其主要排泄途径是尿液和胆汁，而且很可能自胆汁流入肠腔，在肠道菌群或酶的作用下转化为去氢吴茱萸碱原型，部分被小肠重新吸收入血进入体循环，呈现肝肠循环现象，部分随粪便排出。在粪便样品中也检测到了去氢吴茱萸碱原型，并且在另一项研究中，通过绘制去氢吴茱萸碱的“血药浓度-时间”拟合曲线，发现去氢吴茱萸碱出现了明显的双峰，进一步印证了上述推测。在血清和粪便样品中，同时检测到14-甲酰基二氢吴茱萸次碱，推测为原型成分二氢吴茱萸次碱水解和甲酰基化产生的代谢产物，该原型成分在血清和粪便中均被检测到，推测一部分原型成分被直接吸收入血，另一部分原型成分在肠道内发生代谢，代谢产物入血，并通过胆汁排泄，进入肠道后随粪便排出。吴茱萸次碱发生羟基化反应，产生代谢产物羟基吴茱萸次碱，仅在血清中被检测到，推测入血后在体内被进一步代谢，以其他代谢产物形式排泄。吴茱萸碱在体内发生羟基化反应，在血清和尿液中可检测到其代谢产物羟基吴茱萸碱，推测尿液是其唯一的排泄途径。

对于口服药物毒性物质基础的研究，进入血液中的原型成分和代谢产物是研究重点，在血清、胆汁、尿液、粪便中共存的成分更有研究意义[21-23]。目前，对中药体内代谢产物的鉴定，往往局限于有文献报道和先验知识的代谢产物，且仅通过色谱和质谱手段进行分析，结果的可靠性有待验证，还需要在未来的研究中以核磁共振等方法对有意义的代谢物进行验证，得到确切结论。

3 结论

本文应用UPLC-Q-TOF MS/MS技术对灌胃吴茱萸肝毒性部位后进入大鼠胆汁、尿液、粪便中的吴茱萸原型成分及代谢产物进行全面的定性分析及代谢途径解析。在胆汁中检测到4个原型成分和6个代谢产物；在尿液中检测到15个原型成分和5个代谢产物；在粪便中检测到22个原型成分和4个代谢产物。在对代谢产物进行结构表征的基础上，进一步推测了吴茱萸在大鼠体内的代谢途径，包括葡萄糖醛酸结合、硫酸酯化、甲酰基化、羟基化、去甲基化、水解等，并通过比较原型成分和代谢产物在不同生物样本中的分布情况，进一步探索其体内的作用过程，为吴茱萸的肝毒性物质基础及代谢规律研究提供了参考依据。