环境DNA技术在河流生态系统中的应用研究进展

陶 洁，曹 阳，左其亭

(1.郑州大学水利科学与工程学院，河南 郑州 450001；2.郑州市水资源与水环境重点实验室,河南 郑州 450001；3.河南省地下水污染防治与修复重点实验室，河南 郑州 450001;4.郑州大学黄河生态保护与区域协调发展研究院，河南 郑州 450001)

水利水电工程建设运行、污染物超标排放、水生生物过度捕捞等一系列人类活动[1]，改变了原有河流生态系统的生态平衡和水生栖息环境，导致河流生物多样性减少，影响了河流生态系统的健康。河流生物多样性是反应河流健康的重要指标[2]，其传统检测方法，如网捕、电钓等都是通过在调查点捕获样本或者制作成标本再进行鉴定，不但费时费力，对检测物种也不友好。

基于这种情况，环境DNA(environmental DNA， eDNA)技术应运而生，被认为能够有效弥补传统技术的缺陷。eDNA是从生物体(包括皮肤、黏液、鳞屑、尿液、粪便、唾液、配子或遗体等)脱落的细胞内或细胞外的，并悬浮在环境基质(如水、土壤或空气)中的DNA[3-7]。eDNA的产生依赖于生物体的生物量、年龄、摄食活动以及生理、生活史和空间使用[4]，而eDNA技术可以从环境基质中捕获产生的DNA，并将其进行保存、提取、扩增和测序[8]，进而根据测序结果，判断物种种属。这种新型的检测方法已被证明在生物检测中的巨大潜力，经过10多年的发展，它在检测入侵物种、濒危或受到威胁的本土物种以及其他难以用传统方法检测的低密度的物种等方面都有可靠的应用，也被广泛应用在物种分布和丰度的估测等多个领域[9-10]。

由于其高效性、准确性和低成本性，eDNA技术在获取河流的物种信息和解决河流生态相关问题等方面起到了巨大的作用。本文通过查询河流生态系统领域与eDNA技术相关的文献，采用文献计量分析方法对发文状况、主要研究领域、未来研究热点等进行统计分析，综合阐述了eDNA技术在河流生态系统中的应用研究现状，并提出未来重点研究方向。

1 检索方法与结果

1.1 检索方法与数据来源

CiteSpace文献数据可视化软件是一款文献计量分析软件，可以对检索到的论文中的作者、关键词、标题、摘要和被引文献等进行分析，能有效地寻找到研究领域的热点和发展前沿[11]。本文采用该软件对关键词的聚类图、频次以及突现状况进行分析。

研究数据来自中国知网(CNKI)和科睿唯安信息服务公司下属的SCI-Expanded数据库。自1991年起，SCI出版物都增加了摘要，因此在主题搜索中，可以同时从标题、摘要和关键词中收集相关信息并通过分析标题、摘要和关键词可以得到合理详细的主题重点。在数据收集的过程中，为了确保原始数据的准确性和全面性，需要进行检索方法的优化和检索策略的调整，并排除无关的文献。在知网数据库中以“环境DNA”“eDNA”为主题进行高级检索，主题词之间以“或”相连，检索完后，选择“中文文献”来限定范围；在SCI-Expanded数据库中以“environmental DNA”“eDNA”为主题进行检索，主题词之间以“or”相连；由于eDNA技术是Ficetola等[3]于2008年首次应用到水生生物检测中的，故将中外数据库的检索时间跨度均设为“2008—2019年”。

1.2 结果分析

1.2.1论文发表数量和趋势

对获取文献进行整理和精准匹配，同时从标题、摘要和关键词中搜集信息，去除与河流生态系统无关文献，知网检索到的国外作者发文归到国外，SCI-Expanded数据库中检索到的国内作者发文归到国内，最终检索得到46篇国内作者发表的文献和758篇国外作者发表的文献。对国内外发文量进行年度统计(图1)，国外eDNA发文数量在2008—2013年呈平稳趋势，2014年之后逐年稳步提升；国内eDNA的发文量的趋势和国外相同，虽然发文量很低，但近几年来呈明显上升趋势。2013年之后该领域受到了学术界的广泛关注，在一定程度上与其检测监测的优越性有关。

图1 eDNA的发文量

1.2.2关键词频次分析

图2为CiteSpace关键词共现网络图，关键词出现次数越多则字体越大。除了“环境DNA”和“environmental DNA”“eDNA”这些关键词的不同之外，国内eDNA技术研究过程中出现频次较高的关键词有：生物多样性(或物种多样性)、水生生物、生物监测(或物种监测)、水生态系统、coi(指的是线粒体DNA上的一段蛋白质编码基因，主要被生物科学领域用作系统发育研究或DNA条形码研究)等；国外的有：diversity(多样性)、conservation(保护)、temperature(温度)、abundance(丰度)、metabarcoding(宏条形码)等。

(a) 国内发文

(b) 国外发文

网络共现图中存在一些节点，代表被分析的对象，其中频次越高则节点就越大，节点之间的连线表示共现关系，连线越粗表示共现关系越强。国内(图2(a))由于在此方面研究的文献较少，所以节点的大小不够明显，但从国内外发文关键词频次(表1和表2)可知，国内外在研究方向上基本相同，主要集中在生物多样性和物种入侵方面，但是与国内相比，国外的研究呈现更加多元化的趋势，不仅仅局限于eDNA在生物本身的应用，还关注其影响因素、提取方法和PCR技术(又名聚合酶链式反应，是一种用于放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术)等，具体包括：光照、时间和温度等对eDNA浓度的影响机理研究，为防止样品污染而改进提取方法的研究，能带来测序速度和准确率提高的PCR技术更新研究。

表1 国内发文前15个关键词出现频次

1.2.3关键词突现分析

通过对关键词的突现性分析，可以了解不同时间阶段eDNA技术的应用研究情况。表3和表4显示了关键词突变的出现时间以及持续时间。2014—2015年是国内关于eDNA技术研究的开始阶段，主要聚焦在河流生态方面，随着研究的深入逐渐过渡到微观领域对eDNA的测序技术方面，这对水生生物和物种监测研究成为2018—2019年的研究热点起到了一定的推动作用。相比国内，国外eDNA技术的研究要早许多，也不局限于物种监测方面，并且逐渐从eDNA技术本身过渡到对河流环境中DNA的运输、产生和降解及其敏感性的研究。只有深入了解外在因素对eDNA的影响机理，才能通过eDNA技术得到更加精确的检测结果。

表2 国外发文前15个关键词出现频次

表3 2008—2019年国内引文爆发最强的7个关键词突现点

表4 2008—2019年国外引文爆发最强的15个关键词突现点

2 研究进展

2.1 eDNA研究技术手段

eDNA在河流生态系统研究中最常用的两种技术是条形码(barcoding)和宏条形码(metabarcoding)技术。条形码和宏条形码的主要区别在于：条形码主要用特异性引物来对单个DNA片段进行测序，主要针对单一物种[12-14]，检测精度较高；宏条形码则是使用通用引物同时检测来自多个营养水平的各种物种的数百万个DNA片段，主要针对复杂群落[15-16]。DNA条形码对于探测入侵的、稀有的和低密度的物种尤其有用，即使是在研究者难以进入的栖息地，也可以绘制它们的栖息地和物种分布图并且设计相应的保护策略。eDNA宏条形码也已经成功地用于描述过去和现在的生物多样性模式以及研究珍稀濒危物种的产卵生态[17-19]和监测生态系统健康和动态[20-21]。

2.2 eDNA技术应用研究的主要内容

2.2.1物种检测和监测

自从在法国天然池塘水体中成功提取出了美国牛蛙(一种原产于北美的入侵两栖物种)的eDNA[3]，eDNA技术便提高了研究者们对河流生态系统研究的兴趣，并被广泛应用于入侵物种检测、珍稀物种监测等领域[22-23]，这些应用研究证明了eDNA技术有着传统调查方法所缺少的灵敏度、精度和效率。Valentini等[24]利用eDNA技术对骨鱼和两栖动物群体进行检测，得出的结果为该技术和传统方法相比，检出率相同或更高且效率更高。吴昀晟等[25]利用eDNA技术对长江流域的江豚进行监测；Shelton等[26]通过eDNA的浓度对美国华盛顿州斯卡吉特湾濒危的大鳞大马哈鱼进行物种监测；Jo等[27]通过eDNA技术对日本兵库县东南部的3个外来鱼类和3个濒危的本土鱼类进行不同季节的分布检测与监测。以上应用对入侵物种的早期发现、濒危物种管理与监测和濒危物种等的有效保护提供了很大帮助。

eDNA技术解决了传统技术在检测和监测入侵、未知和濒危物种时费时、费力等问题，对物种分布的长期监测、珍稀濒危物种的保护和入侵物种的预防以及政府政策的制定都能起到很大的作用。

2.2.2物种生物量估测

准确了解物种在河流环境中的生物量有助于维持河流生态系统的健康。研究表明，eDNA浓度与环境中的生物量正相关，因此，eDNA浓度可以在一定程度上反映物种的生物量[28-30]。Takahara等[31]利用eDNA技术来检测实验室和池塘试验以及淡水湖泊实地调查的eDNA浓度，对比进行鲤鱼的生物量估测，得出eDNA浓度能反映目标物种生物量，并可据此推测自然环境中的鲤鱼分布情况。Dougherty等[32]利用传统诱捕小龙虾的方法和eDNA技术对美国中西部地区内陆湖中入侵的锈斑小龙虾(Orconectesrusticus)进行了监测及相对丰度估测，结果表明eDNA技术检测物种的成功率随该物种相对丰度的增加而增加。Doi等[33]在日本濑户内海西部Suonada湾的Saba河进行了eDNA试验,得出eDNA浓度与香鱼的生物量呈显著正相关关系。

虽然能够通过eDNA技术检测eDNA浓度来快速评估物种的生物量，但是通过eDNA浓度对生物量的准确估计仍然具有挑战性，并取决于多种因素，如个体释放到水中的DNA数量、河流的运输率和eDNA随时间和温度的稳定性等[34]。此外，行为和季节也会影响物种的检测和利用eDNA浓度对丰度的估测。因此，在应用定量eDNA方法之前，需要对这些误差进行量化。

2.2.3生物产卵繁殖调查

掌握河流水生生物的繁殖活动对于物种多样性的保护和管理非常重要。eDNA技术可以通过检测水体中eDNA的浓度分布来确定生物产卵的空间范围。Bylemans等[17]通过eDNA技术对濒危的澳洲麦氏鲈进行产卵活动监测。Maruyama等[18]使用qPCR技术(实时荧光定量PCR技术)对日本受威胁的本地三唇马口鱼的繁殖迁移进行了非侵入性监测。Antognazza等[19]以qPCR技术为基础，提出了鲱鱼(Alosa)的eDNA检测方法，并在英格兰西部Teme河上进行了检测，确定了鲱鱼产卵期的持续时间和空间分布范围，并对鲱鱼的空间分布进行了评估。

更有研究者发现繁殖时期eDNA在水体中的浓度会显著增加，并且只在一定的空间范围内显著变化。基于此，了解物种在何时何地发生繁殖行为，明确繁殖期与非繁殖期eDNA浓度与生物资源量的定量关系，可以更精确地了解其如何影响生物量的预测。

2.2.4生物多样性检测

在全球气候变化和人类活动的影响下，生物多样性正在快速地丧失，全球正经历第六次生物多样性危机[35]。保护生物多样性是一项全球性的挑战，它需要大量不同时空尺度上的物种分布和数量数据。传统方法调查生物多样性往往存在效率低下、生物损伤、环境破坏等缺点，eDNA技术提供了一种新的方法来评估生物多样性，只需要少量的水样便能可靠地检测出水环境中的目标生物，包括入侵的、濒危的和当地的物种[36-40]。Lacoursière-Roussel等[41]通过eDNA技术检测北极两个港口采集到的水样，成功鉴定出了181个物种。Jo等[42]进行的鱼类多样性调查显示，eDNA技术检测的平均种数为19(±4.4)种，略高于常规调查得到的10(±4.8)种，但在对韩国特有物种和外来物种的鉴定中显示，通用引物(Mi-Fish引物集)并不适用，此外，一些常规方法捕获的濒危物种也没有被eDNA技术检测到，所以需要对通用引物进行开发或补充，以便eDNA技术能识别更多的韩国本地淡水鱼。在eDNA技术的支持下，分析生物多样性也变得更加便捷，但需要更丰富的引物集来和DNA序列进行配对，才能识别更多的物种。

生物多样性检测依赖于精确快速的基因测序技术，目前它已经发展到第三代。第三代基因测序技术[43-44]采用单分子读取技术，并且不需要进行PCR扩增处理，具有更高的通量和测序效率，操作过程更简便，测序速度更快，读长更长，可达几千个碱基，可进一步节省测序成本，同时克服了传统检测分析中错误频率较高的问题，这对于提高eDNA技术在物种检测方面的检出率有很大帮助。

此外，eDNA技术在河流水质评价和水污染评价[45-46]、病原体的检测[47-49]等方面也有应用，如eDNA序列的种类、浓度大小及变化速率、浓度分布等可以反映出指示生物的多样性和物种丰度及其变化、指示物种的群落分布及结构变化、食物链食物网的能量流动、动植物的相互作用以及其在维持生态系统功能和提供生态系统服务中的作用等[50-51]；在病原体检测方面，eDNA技术可监测河流环境中物种携带的病原体，这能起到很好的疾病预防作用。

3 研究展望

eDNA技术是集高效、精准和标准化为一体的新一代生物物种和多样性检测和监测工具，相较于传统调查方法具有明显优势，随着第三代基因测序技术的发展，eDNA技术检测和监测结果更加精确，在河流生态环境和物种保护中也发挥着更广泛的作用。然而作为一种新技术，未来eDNA技术在河流生态系统中的应用研究应着重在以下几个方面：

a.开展生物及非生物因素对eDNA浓度的影响机理研究。虽然eDNA技术在物种生物量估测和生物多样性分析等方面具有巨大的潜力，但因为生物及非生物因素的影响，该技术大面积应用还存在一定的局限性。例如，eDNA的产生率和降解率直接影响着河流中的eDNA浓度，eDNA的持久性、转移和沉降等间接影响着河流中的eDNA浓度，所以未来应该建立eDNA浓度与生物、非生物因子之间的量化关系，以有效提高eDNA定量检测结果的准确性。

b.因地制宜地丰富公共数据库，开发设计适合当地的通用引物。虽然通用引物能同时检测出许多物种，但由于物种的生理特征和环境因素的不同，会导致通用引物的检测出现检测不出或结果错误的状况，且目前对河流生态系统的群体质量信息掌握不够。因此加强通用引物设计和数据库扩展对检测当地河流生物群体信息、生物多样性、物种入侵以及制定物种保护政策非常重要。

c.开展eDNA采样、保存、运输、提取、分析等全过程标准研究和制定。统一的标准是确保样本研究过程和结果具有可对比性的重要条件。

d.将传统调查方法和eDNA技术结合。eDNA技术作为新兴技术，还有着其不完善的地方，而传统调查方法虽然缺点明显，但是它的调查过程更直观、识别率更高，并且不为地域所限，将两者有效结合，可以互相弥补，显著提升河流物种检测和监测精度。但是在具体使用过程中如何结合需要进一步探索。

e.拓展eDNA技术的应用研究范围。除了应用在河流生物入侵检测和监测等方面，未来eDNA技术应加强在食物网、检测物种体内病原体、能量流动等方面的应用研究，便于更全面地了解河流生态系统进程，掌握河流健康动态。