多依果醋发酵工艺优化及品质分析

黄艳丽，李成华，杨永林，周晓龙，尹锦荣，虞志君，赵猛*

（1.云南农业大学热带作物学院，云南 普洱 665000；2.农产品质量安全与营养健康科普工作站，云南 普洱 665000）

多依果又称栘衣果，是蔷薇科栘[木衣]属热带植物云南栘[Docynia delavayi（Franch.）Schneid.]的果实，在我国主产于云南、贵州等地[1-3]。其药食兼用，富含多种营养物质和多酚类活性成分，具有健胃消食和抗衰老等功能[4-6]。多依果是云南地方特色水果，仅云南糯扎渡镇种植面积就达12 000多亩。

多依果的常见吃法是舂碎后拌以调料生吃，但因质地酸涩不符合外地人口味，受限于地域环境难以推广。其传统加工方式有泡果、果酱、果饮料等多种形式[7-9]，但方式简单，附加值低。相关研究表明，多依果富含抗氧化活性成分[10-18]，将其酿造成果醋，尽可能的保存其功能性成分，可大大增加多依果的经济效益，推动多依果产业的现代化发展。

10月份～12月份是多依果的成熟采摘期，此时云南普洱室温（17℃～24℃）可满足多依果发酵温度条件。本研究以云南特色水果多依果为原料，室温（17℃～24℃）条件下，经过醋酸发酵，以总酸度、可溶性固形物含量及感官评分为评价指标，采用单因素结合响应面法优化多依果醋的酿造工艺参数，并对其总黄酮成分和体外抗氧化活性进行测定，旨在酿造一款较好保存多依果抗氧化活性功能的果醋，为多依果的深加工提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

多依果（成熟期）：市售；安琪果酒酵母：安徽中科中佳公司；醋酸菌：山东和众康源生物科技有限公司。

焦亚硫酸钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；芦丁（纯度级别≥98%）、DPPH、ABTS（分析纯）：合肥博美生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

LH-B55数显折光仪：杭州陆恒生物科技有限公司；GMK-702R糖度测定仪：北京西诺远大科技有限公司；UV-1800PC-DS2紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；pH-100手持式pH计：上海力辰邦西仪器科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 多依果醋加工工艺流程及操作要点

1.3.1.1 加工工艺流程

1.3.1.2 操作要点

（1）鲜果准备：挑选成熟期多依果鲜果，洗净，晾干。

（2）打浆：鲜果去皮、切块，按料液比 1∶2（g/mL）称重、加水、打浆。

（3）酶解：果浆中添加0.2%的果胶酶，室温（17℃～24℃）酶解 6 h。

（4）糖度调整：添加26%的白砂糖，以达到多依果酒精发酵所需的酒精度（10.8%vol）要求。

（5）灭菌：添加二氧化硫（60 mg/kg）进行灭菌。

（6）酵母菌接种：称取4%的酵母菌粉，水浴活化30 min，接入发酵液中。

（7）初始pH值调整：加入柠檬酸，调节发酵液pH值为3.4。

（8）酒精发酵：室温（17℃～24℃）发酵6 d。

（9）酒精度调整：加水稀释多依果酒至试验所需酒精度。

（10）醋酸菌接种：按试验所需称取醋酸菌粉，活化培养48 h，接入发酵液中。

（11）装料：按试验所需比例将调配好的原料装入发酵罐中。

（12）醋酸发酵：室温（17℃～24℃）发酵试验所需时间。

（13）过滤：发酵液纱布过滤，得多依果醋成品。

1.3.2 多依果醋发酵工艺优化

1.3.2.1 单因素试验

试验前进行预试验，得初始发酵适宜条件为初始酒精度7%vol、醋酸菌接种量0.3%、装料量40%，室温（17℃～24℃）发酵15 d。在预试验基础上，以可溶性固形物含量、酸度和感官评分为评价指标，考察初始酒精度（5%vol、6%vol、7%vol、8%vol、9%vol）、醋酸菌添加量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、装料量（20%、30%、40%、50%、60%）和发酵时间（9、12、15、18、21 d）对多依果醋发酵的影响。

1.3.2.2 响应面优化试验

基于单因素试验，选择初始酒精度（A）、醋酸菌接种量（B）、装料量（C）和发酵时间（D）为考察因子，以感官评分为响应值（Y），采用Box-Behnken试验方法进行四因素三水平的响应面优化试验。响应面试验设计见表1。

表1 多依果醋酿造工艺响应面优化试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation technology optimization of D.delavayi fruit vinegar

1.3.3 指标测定方法

1.3.3.1 感官评定

多依果醋感官评定参照NY/T 2987—2016《绿色食品果醋饮料》中感官检验与要求制定，具体评定标准见表2。

表2 多依果醋酸发酵感官评分Table 2 Sensory evaluation standards of D.delavayi fruit vinegar

1.3.3.2 理化和微生物指标

总酸参照GB 12456—2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》中酸碱指示剂滴定法测定；可溶性固形物含量参考GB/T 12143—2008《饮料通用分析方法》中折光计法测定；菌落总数参考GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》测定；大肠菌群计数参照GB 4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》测定。

1.3.3.3 总黄酮含量的测定

总黄酮含量参考SN/T 4592—2016《出口食品中总黄酮的测定》测定。

1.3.3.4 体外抗氧化活性测定

抗氧化性参考GB/T 39100—2020《多肽抗氧化性测定 DPPH和ABTS法》测定。

样品溶液多依果醋的制备：采用响应面优化的最佳工艺参数酿造的多依果产品；原果汁：果肉与水料液比1∶2（g/mL）；维生素 C：0.15%维生素 C 水溶液。

1.4 数据处理与分析

采用Design-Expert 8.0进行响应面试验设计与分析，Origin 2018进行数据处理与绘图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 初始酒精度对多依果醋发酵的影响

初始酒精度对多依果醋发酵的影响见图1。

图1 初始酒精度对多依果醋发酵的影响Fig.1 Effect of initial alcohol content on acetic fermentation of D.delavayi fruit

由图1可知，初始酒精度在5%vol～9%vol时，随着酒精度的增加，多依果醋的总酸度呈先上升后趋于平缓的趋势，感官评分和可溶性固形物含量均呈现先上升后下降的趋势。在初始酒精度为7%vol时，感官评分达到最高（89分），总酸度为4.0 g/100 mL。酒精度大于7%vol后，产酸量逐步放缓，也影响果醋的口感[19]。因此，综合考虑选取醋酸发酵初始酒精度为7%vol。

2.1.2 醋酸菌接种量对多依果醋发酵的影响

醋酸菌接种量对多依果醋发酵的影响见图2。

图2 醋酸菌接种量对多依果醋发酵的影响Fig.2 Effect of acetic acid bacteria on acetic fermentation of D.delavayi fruit

由图2可知，醋酸菌接种量在0.1%～0.5%时，随着醋酸菌的增加，多依果醋的总酸度呈先上升后趋于平缓的趋势，感官评分和可溶性固形物含量均呈现先上升后下降的趋势。在醋酸菌接种量为0.4%时，感官评分达到最高（91分），总酸度为4.2 g/100 mL。醋酸菌接种量大于0.4%后，产酸量变化很小，果醋的口感反而下降。因此，综合考虑选取醋酸菌接种量为0.4%。

2.1.3 装料量对多依果醋发酵的影响

装料量对多依果醋发酵的影响见图3。

图3 装料量对多依果醋发酵的影响Fig.3 Effect of loading amount on acetic fermentation of D.delavayi fruit

由图3可知，装料量在20%～60%时，随着装料量的增加，多依果醋的总酸度和可溶性固形物含量均呈先上升后趋于平缓的趋势，感官评分呈现先上升后下降的趋势。在装料量为40%时，感官评分达到最高（88分），总酸度为4.3 g/100 mL。装料量大于40%后，虽然产酸量增多，但果醋的口感下降。因此，综合考虑选取醋酸发酵装料量为40%。

2.1.4 发酵时间对多依果醋发酵的影响

发酵时间对多依果醋发酵的影响见图4。

图4 发酵时间对多依果醋发酵的影响Fig.4 Effect of fermentation time on acetic fermentation of D.delavayi fruit

由图4可知，发酵时间在9 d～21 d时，随着发酵时间的增加，多依果醋的总酸度呈先上升后平缓的趋势，感官评分和可溶性固形物含量均呈现先上升后下降的趋势。在发酵时间为15 d时，感官评分达到最高（91分），总酸度为4.5 g/100 mL。发酵15 d后，总酸度变化较小，果醋口感反而下降。因此，选取醋酸发酵时间为15 d。

2.2 醋酸发酵响应面优化与分析

感官评价是果醋的重要指标，因此醋酸发酵试验以感官评分为响应值。响应面试验优化结果见表3，方差分析结果见表4。

表3 醋酸发酵响应面试验优化结果Table 3 Experimental result of response surface design of acetic fermentation

表4 回归模型方差分析Table 4 ANOVA for response surface quadratic model

感官评分（Y）回归拟合方程：Y=92.60+0.67A+0.75B+1.08C-1.00D+0.50AB+1.50AC-3.00AD-1.50BC+0.25BD+1.75CD-6.63A2-3.76B2-7.51C2-4.63D。由表4可知，模型P值＜0.000 1，达到高度显著水平，表明所得方程有意义；失拟项P值为0.880 8，不显著，表明所构建的模型合理，与试验的差异较小；相关系数R2pred为0.947 0，调整系数R2adj为0.971 4，变异系数＜3%，表明预测值与试验值有较好的相关性，误差较小；模型的信噪比为25.906，远大于4，则表明该模型适用于多依果醋酸发酵感官评分的预测。在该模型中，一次项A、B、C、D 和交叉项 AC、AD、BC、CD 以及二次项 A2、B2、C2、D2对结果影响极显著（P＜0.01），其他因素组合对结果无显著影响（P＞0.05）。根据F值大小可知，4个因素对多依果酒发酵影响的顺序：初始酒精度（A）＞装料量（C）＞发酵时间（D）＞醋酸菌接种量（B）。

根据回归方程对试验结果进行优化，得多依果醋酸发酵的最优条件：初始酒精度7.18%vol，醋酸菌接种量0.41%，装料量40.6%，发酵时间14.52 d，在此工艺条件下，多依果醋的感官评分理论值为92.88分。根据实际情况将工艺参数修正为初始酒精度7%vol，醋酸菌接种量0.4%，装料量40%，发酵时间15 d。按修正后的工艺参数值进行验证试验，得到多依果醋的实际感官评分为94分，与理论值相对误差为1.20%。由此可知，采用响应面法优化多依果醋酿造工艺条件是准确可行的，模型可用。

2.3 多依果醋品质分析

对按照最优发酵工艺参数制备的多依果醋进行各项指标测定和品质分析。

2.3.1 感官评定

多依果醋为黄橙色，具有多依果的特征香气，酸甜适中，口感谐调，感官评分为94分。

2.3.2 理化和微生物指标测定

多依果醋可溶性固形物含量为（11.3±0.03）%，总酸含量为（4.42±0.15）g/100 mL，菌落总数为（12.5±1.1）CFU/mL，大肠菌群未检出。多依果果醋各项指标检测结果均符合NY/T 2987—2016《绿色食品果醋饮料》的标准要求。

2.3.3 活性成分总黄酮含量分析

黄酮类化合物有保护心血管系统和提高人体免疫力的功效，而且在清除自由基方面也作用明显[20]。以芦丁含量y（mg/mL）为纵坐标，吸光度x为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为y=0.030 2x-0.000 7，相关系数R2=0.999 050。经计算得多依果醋中总黄酮含量为（3.83±0.12）mg/L。

2.3.4 多依果醋体外抗氧化活性分析

将多依果醋对DPPH和ABTS+自由基的清除能力与多依果的原果汁、维生素C相比较，结果如图5所示。

图5 多依果醋、原果汁和维生素C对DPPH和ABTS+自由基清除能力Fig.5 The free radical scavenging ability of DPPH and ABTS+of fruit vinegar，raw juice and vitamin C

多依果醋、原果汁和维生素C对DPPH和ABTS+自由基清除能力变化趋势基本一致，随着样品用量的增加而逐渐增大，均呈现持续上升后趋于平缓的总体趋势。维生素C作为纯净物，对DPPH和ABTS+自由基清除能力始终略高于多依果醋和多依果的原果汁。从图5A可知，样品用量在0.4 mL～1.6 mL时，多依果醋、原果汁对DPPH自由基的清除率持续上升，且多依果醋对DPPH自由基的清除能力略高于原果汁；随后变化趋势趋于平缓，果醋对DPPH自由基的清除率最高达到86.8%。从图5B可知，样品用量在0.1 mL～0.3 mL时，多依果醋、原果汁对ABTS+自由基的清除率持续上升，较低量时多依果醋对ABTS+自由基的清除能力略低于原果汁，但随着样品用量的增加，多依果醋的清除率逐渐高于原果汁；随后变化趋势趋于平缓，多依果醋对ABTS+自由基的清除率最高达到80.2%。由此可知，多依果醋较好的保留了多依果的抗氧化活性成分。

3 结论

多依果室温（17℃～24℃）下经酒精发酵得果酒，酒精稀释后进一步醋酸发酵制得多依果醋。通过Box-Behnken响应面法设计和优化多依果醋酸发酵工艺，以感官评分为响应值确定最佳醋酸发酵工艺参数为初始酒精度7%vol、醋酸菌接种量0.4%、装料量40%和发酵时间15d。在此优化酿造工艺条件下，多依果醋为黄橙色，具有多依果的特征香气，酸甜适中，口感谐调，感官评分为 94分，总酸含量为（4.42±0.15）g/100 mL，各项指标检测结果均符合NY/T 2987—2016《绿色食品果醋饮料》的标准要求。同时，测得多依果醋中总黄酮含量为（3.83±0.12）mg/L，对 DPPH 和 ABTS+自由基的清除率最高可达86.8%和80.2%，果醋自由基清除率与多依果的原果汁相近而略低于维生素C。多依果醋较好的保留了多依果的总黄酮和抗氧化活性成分。