结核病重组蛋白亚单位疫苗研究进展

曹倩倩 祝秉东 牛红霞

卡介苗(BCG)是唯一可用于临床的结核病疫苗，但是其保护效果仍存在不确定性[1-2]。据报道，BCG可预防新生儿及儿童罹患结核性脑膜炎和粟粒性结核病等，但其对成人肺结核的保护效果欠佳[3]。全球结核病疫情仍然十分严峻[4]，迫切需要研发新型结核病疫苗。根据疫苗的组分或免疫策略，新型在研结核病疫苗分为结核分枝杆菌减毒活疫苗、重组BCG、病毒载体疫苗、结核分枝杆菌灭活疫苗和重组蛋白亚单位疫苗等类型[5]。其中，重组蛋白亚单位疫苗基于结核分枝杆菌保护性抗原蛋白及免疫佐剂构建，其成分明确、安全性好，且可通过诱导机体产生较多的中央记忆性T细胞提供长期免疫保护效果[6]。此外，重组蛋白亚单位疫苗还可作为治疗性疫苗用于结核分枝杆菌潜伏感染的治疗。笔者现将结核病重组蛋白亚单位疫苗的研究进展综述如下。

一、结核分枝杆菌保护性抗原

应用基因工程技术构建重组蛋白亚单位疫苗，首先需要筛选有效的结核分枝杆菌保护性抗原。结核分枝杆菌菌体成分复杂，含有大量脂质、多糖及近4000种蛋白质，不同成分均具有一定的免疫原性。根据抗原的不同特性分为以下几种类型：

1.细胞壁及菌体表面抗原：结核分枝杆菌细胞壁和荚膜含有大量的糖脂，如索状因子、脂阿拉伯甘露聚糖、脂甘露聚糖、葡萄糖单霉菌酸酯、磷脂酰肌醇甘露糖苷等[7]。其中，索状因子是分枝菌酸与海藻糖结合所形成的一种糖脂，可以刺激巨噬细胞释放促炎因子，提高机体体液免疫和细胞免疫应答；脂阿拉伯甘露聚糖、脂甘露聚糖与葡萄糖单霉菌酸酯可激活T细胞免疫应答，降低细菌载量[8-9]。由此可见，结核分枝杆菌的这些糖脂组分可作为结核病疫苗候选抗原或佐剂。但是，糖脂抗原难以用生物工程的方法进行制备，且分离纯化单一组分困难，其在疫苗中的应用还需更多探索。

结核分枝杆菌细胞壁和荚膜的脂蛋白和糖蛋白同样具有免疫原性，也可作为疫苗的候选抗原[10-11]。肝素结合血凝素是菌体表面黏附素，帮助结核分枝杆菌黏附在宿主细胞表面，促进肺外感染的发生[12]。肝素结合血凝素不但能够刺激机体产生血清抗体和呼吸道黏膜抗体，还能够激活Th1和Th17型细胞免疫应答[13]。结核分枝杆菌菌毛蛋白能够与宿主细胞层粘连蛋白结合，在激活黏膜免疫应答方面强于分泌性蛋白。因此，结核分枝杆菌菌体表面的这些脂蛋白和糖蛋白在重组蛋白亚单位疫苗研发中同样具有重要意义[14]。

2.分泌性抗原：结核分枝杆菌可以分泌大量蛋白到菌体外，有些分泌蛋白抑制宿主免疫应答促进免疫逃逸[15]，有些分泌蛋白则可以激活免疫信号通路诱导免疫应答[16]。据报道，结核分枝杆菌分泌的具有抗原性的蛋白有：Ag85复合物、早期分泌抗原靶6(ESAT-6)、培养滤液蛋白10(CFP-10)、MPT64、Rv3841、MPT63、Mtb8.4、KatG、Mtb81、MTB48、MTB12等。Ag85复合物由3种分泌蛋白Ag85A、Ag85B和Ag85C组成，其作为毒力因子有助于病原菌对宿主细胞的黏附、侵袭和播散，在结核分枝杆菌的致病中发挥关键作用[17]。ESAT-6是一种低相对分子质量、早期分泌具有免疫原性较强的抗原，可以在结核分枝杆菌感染期持续表达，诱导较强的T细胞免疫应答。CFP-10是一种结核分枝杆菌培养滤液蛋白，能够有效激活 T细胞免疫应答[18]。Mtb10.4属于ESAT-6家族成员，在结核病患者和BCG接种人群中可以诱导强烈的T细胞免疫应答[19]。分泌性抗原除了免疫原性强的优势外，还易于异源表达和制备，是理想的重组蛋白亚单位疫苗候选抗原。比如，Ag85B、ESAT-6和CFP-10在重组蛋白亚单位疫苗构建中被广泛应用[15，20]，候选疫苗GamTBvac(Ag85A-ESAT-6-CFP-10/CpG ODN)处于Ⅱ期临床试验。

3.生长期抗原和休眠期抗原：结核分枝杆菌生长周期，根据不同的代谢状态可分为复苏期、复制期和休眠期多个阶段。在不同的代谢状态下，结核分枝杆菌表达的抗原谱不尽相同，即每个生长阶段有不同的免疫优势抗原。据报道，结核分枝杆菌复苏期优势表达抗原有Rv2787、Rv2450c、Rv1774、Rv1794等[21]；复制期优势表达抗原有Mtb10.4、Mtb8.4、ESAT6、Ag85B等[22]；休眠期优势表达抗原有HspX、Rv2626c、Rv2007c、Rv1738、Rv3130c等[23]。感染人体的结核分枝杆菌并不是单一代谢状态，而是包含不同生长阶段的结核分枝杆菌，并且不同代谢状态的细菌在一定条件下会相互转换[24]。因此，理想的重组蛋白亚单位疫苗应该是包含不同代谢状态结核分枝杆菌优势抗原的多阶段疫苗[25]。目前，多阶段疫苗ID93(Rv2608-Rv3619-Rv3620-Rv1813)和H56(Ag85B-ESAT-6-Rv2660c)处于Ⅱ期临床试验阶段，且显示出较好的临床保护效果。笔者课题组用休眠期抗原HspX和Rv2626，分别与复制期抗原Mtb10.4、ESAT-6、Mtb8.4、Ag85B融合，构建了多阶段疫苗MH(Mtb10.4-HspX)、LT69(ESAT-6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-Hspx)和LT70(ESAT-6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-Rv2626c)，毒株攻击实验结果显示多阶段疫苗比单一复制期抗原所构建疫苗具有更好的保护效果[26-28]。

4.BCG缺失区抗原：通过比较基因组学研究发现，与牛分枝杆菌标准株相比，BCG毒力降低的原因是缺失了编码毒力因子的多个基因。这些缺失的基因组片段被称为BCG缺失区(regions of deletion，RD)。结核分枝杆菌免疫保护性抗原ESAT-6、CFP-10、MPT64、Rv1978等都属于BCG的RD区抗原[29]。此外，RD区抗原Rv3619c、Rv3620c、Rv3872、Rv3873、Rv1984、Rv3117、Rv2346c、Rv3425等也被发现具有较强的免疫原性。BCG保护效果不理想，可能与丢失的大量编码保护性抗原基因相关[30]。因此，重组蛋白亚单位疫苗构建时，应关注BCG缺失区抗原。

二、佐剂

免疫佐剂是重组蛋白亚单位疫苗设计的关键成分。结核分枝杆菌是胞内寄生菌，体液免疫保护效果欠佳，需要诱导Th1和Th17型细胞免疫应答来对抗其感染。Toll样受体(Toll-like receptors，TLR)激动剂可与蛋白或多肽结合，刺激机体产生有效的细胞免疫应答[31-32]。目前，重组蛋白亚单位疫苗佐剂主要基于Toll样受体激动剂，如IC31由阳离子抗菌肽KLKL5KLK和合成的TLR-9激动剂寡脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotide，ODN1a)组成[33-34]；AS01是由单磷酰脂A(monophosphoryl lipid A，MPL)和皂角苷(QS-21)组成的油包水型乳剂，其中，MPL为多糖解毒衍生物可激活TLR-4介导的天然免疫应答[35-36]。GLA-SE为含吡喃葡萄糖基脂质(glucopyranosyl lipid adjuvant，GLA)的角鲨烯水包油型乳剂，GLA为TLR-4激动剂，可诱导树突状细胞成熟和增强Th1型细胞免疫应答[37]。CpG ODN(CpG o1igodeoxynucleotides)是人工合成含有非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)的寡脱氧核苷酸，其为TLR-9激动剂，可通过增强抗原递呈提高体液免疫应答和细胞免疫应答[38]。笔者课题组应用二甲基三十六烷基铵(dimo-thy-lidioctyl ammonium bromide，DDA)和TLR-3激动剂聚肌胞苷酸(Poly Ⅰ:C)制备DDA-Poly Ⅰ:C(DP)佐剂。其中，DDA是一种阳离子脂质体，可将蛋白抗原递呈给抗原递呈细胞诱导Th1型细胞免疫应答；Poly Ⅰ:C是TLR-3激动剂，可诱导天然免疫应答和适应性免疫应答。DP佐剂与结核分枝杆菌融合抗原联合免疫小鼠，显示出较好的佐剂效应和安全性[39-40]。此外，干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes，STING)通路激活剂环二核苷酸可以诱导Th17型的细胞免疫应答，且显示较强的抗结核保护效果[41]。因此，可考虑基于STING通路激活剂开发更多的重组蛋白亚单位疫苗适用佐剂。

三、进入临床试验阶段的重组蛋白亚单位疫苗及其保护效果

目前，全球至少有14种结核病疫苗进入临床试验阶段，包括6种重组蛋白亚单位疫苗，分别是AEC/BC02、ID93/GLA-SE、GamTBvac、H56/IC31、H4/IC31和M72/AS01E。H4/IC31候选疫苗因保护效果不佳，已终止临床试验[5]。AEC/BC02是国内第一个进入临床试验的结核病疫苗，主要用于结核分枝杆菌潜伏感染人群的免疫预防，目前已经完成Ⅰ期临床试验(NCT03026972)，正在开展Ⅰb期临床试验(NCT04239313)[42]。处于Ⅱa期临床试验的候选疫苗有：(1)ID93/GLA-SE：在南非多地对接种过卡介苗的结核病患者，开展免疫治疗的临床效果评价[43]。(2)GamTBvac：在一项包括180名接种过BCG的健康志愿者的临床试验中，评价该疫苗的安全性和免疫原性[44]。临床试验结果显示，ID93/GLA-SE和GamTBvac候选疫苗均可在人体诱导持久的抗原特异性体液免疫和细胞免疫应答。处于Ⅱb期临床试验阶段的疫苗有：(1)H56/IC31候选疫苗：该疫苗经Ⅰ期临床试验评价，显示出良好的安全性和较强的免疫原性[20]。Ⅱ期临床试验结果显示，在感染和未感染结核分枝杆菌的成人中低剂量接种2次或3次，均可诱导持久的抗原特异性CD4+T细胞免疫应答[45]。(2)M72/AS01E候选疫苗：Ⅱ期临床试验结果显示，在18～50岁的HIV阴性的结核分枝杆菌潜伏感染者中，该疫苗对活动性肺结核发病的保护率为54%(90%CI：14%～75%，P=0.04)[46-47]；但是，其3年的随访结果显示保护率下降到49.7%(90%CI：12.1%～71.2%)[48]。上述疫苗在受试人群中可以诱导有效的体液免疫和细胞免疫应答，均没有观察到出现严重的不良反应，少数不良反应为局部炎症反应和轻微的肌肉酸痛等。综上所述，重组蛋白亚单位疫苗具有很好的安全性，并可具有一定的保护效力。

四、重组蛋白亚单位疫苗应用策略

BCG接种主要诱导机体产生效应记忆性T细胞和效应T细胞。然而，效应记忆性T细胞不能够提供长期的免疫保护[49]。中央记忆性T细胞在疫苗长期保护作用中发挥更为关键的作用[50]。据报道，重组蛋白亚单位疫苗具有成分单一、安全性高，可诱导机体产生较多的中央记忆性T细胞[51]，因此，可作为强化疫苗用于加强BCG的效应。以重组蛋白亚单位疫苗H56为例，在小鼠和食蟹猴感染模型采用BCG初免、重组蛋白亚单位疫苗加强免疫策略，结果表明，加强免疫的长期保护效果明显优于BCG单独免疫组[52-53]。BCG是我国免疫规划预防接种疫苗，人群普遍接种，因此，重组蛋白亚单位疫苗作为强化疫苗应用易被接受且符合我国国情。此外，重组蛋白亚单位疫苗LT69在小鼠体内单独免疫3次，在末次免疫后30周可提供与BCG相当的保护效果[27]；H56在小鼠体内单独免疫3次，在末次免疫后24周可提供比BCG更好的保护效果[52]。因此，重组蛋白亚单位疫苗同样具有单独应用替代BCG的应用前景。

研究发现，在人和实验动物中采用皮内注射BCG保护效果不佳[54]。在恒河猴体内，与其他注射途径(皮内、皮下或气雾)相比，静脉注射BCG能够提供更好的保护效果[55-56]。重组蛋白亚单位疫苗接种剂量和加强次数也是影响免疫效果的关键。重组蛋白亚单位疫苗通常需要多次加强免疫才能获得有效的免疫记忆，但并不是加强次数越多越好，强化免疫次数太多可诱导调节性T细胞的产生，降低疫苗的保护效果[57]。重组蛋白亚单位疫苗接种策略通常为间隔2周或3周加强免疫，即0-2-4或0-3-6周的3次免疫方案。笔者课题组研究发现，0-4-12周加强免疫的方案诱导的中央记忆性T细胞的数量更多[6]。因此，重组蛋白亚单位疫苗的最佳免疫途径及策略还有待进一步研究。

五、重组蛋白亚单位疫苗研究面临的挑战

建立有效动物模型将为疫苗评价提供关键支撑。结核病候选疫苗通常在小鼠模型中进行初步效果评价。此模型成本较低且易于基因改造获得基因改造小鼠，但是小鼠和人的生理和免疫特征有较大的差距，不能模拟人类结核分枝杆菌感染的真实状态。猕猴与人的亲缘关系更近，常用于结核病疫苗临床前保护效果的评价，但是其购买和饲养成本较高。豚鼠感染结核分枝杆菌后与人类感染具有相似的病理特征，是结核病疫苗研究的良好动物模型。但是该模型也存在可用的免疫检测试剂有限、饲养条件要求高等缺点，因此，没有作为结核病疫苗研究的主要动物模型使用。此外，人源化小鼠可克服上述动物模型的缺点，可用于评价结核病疫苗的动物模型的建立[58]。

γ-干扰素等Th1型的细胞因子通常作为结核病疫苗评价的免疫检测指标，但是其与疫苗的保护效果和保护周期的相关性还没有确切的定论。目前认为，T细胞免疫记忆反应，尤其是中央记忆性T细胞的数量和质量决定疫苗的长期保护效果。此外，黏膜分泌的分泌型免疫球蛋白A抗体可以阻断结核分枝杆菌与巨噬细胞及上皮细胞的结合，发挥保护性免疫作用[59]。因此，体液免疫，尤其是黏膜免疫在结核病疫苗保护中的作用也需关注。

六、总结与展望

BCG在临床应用有近百年的历史，但是全球结核病疫情仍然十分严峻，提示结核病预防仍然缺乏高效的疫苗。在研的新型结核病疫苗中，重组蛋白亚单位疫苗可提供长期的免疫保护效果，且成分明确、安全性好，具有较好的应用开发前景。随着基因组学、分子生物学等学科的发展，人们对结核分枝杆菌的保护性抗原及佐剂的认识进一步提高。目前，全球已有6种结核病重组蛋白亚单位疫苗正在开展不同阶段的临床试验。虽然结核病重组蛋白亚单位疫苗的研究进展令人鼓舞，但是其接种途径、免疫策略和递送系统等方面还有很多问题需进一步探索。