环状RNA在妊娠期高血压患者中的表达及潜在作用机制

王健，史云，顾秀峰，李玉明，胡金朋

美国妇产科医师学会发布的“妊娠期高血压和子痫前期指南2019版”，妊娠期高血压是指妊娠第20周后新发生的收缩压和/或舒张压≥140/90 mmHg，分娩后血压可恢复正常，妊娠期高血压是妊娠期严重的并发症之一，可引起母婴的不良结局[1]。每年约有5万余名孕妇死于妊娠期高血压，但其确切发生机制仍未阐明。目前认为反复的缺氧/缺血和再灌注、浅层滋养细胞浸润、反应性氧化产物增多、全身炎症、上皮功能障碍和血栓形成等是妊娠期高血压的病理基础[2]。临床上多采用解痉、扩容、降压等对症治疗，但是除终止妊娠外，尚无有效的治愈手段[3]。由于分娩是治愈妊娠期高血压的唯一方法，因此有些学者认为胎盘结构和功能的改变与妊娠期高血压的发病有关。胎盘滋养层细胞承担着大部分的胎盘交换、内分泌和屏障功能，对滋养层细胞生物学行为调控因子的研究可能有利于帮助我们理解妊娠期高血压的发病机制。近年来，环状RNA(circular RNA, circRNA)作为一种潜在的关键调控因子受到了广泛关注。circRNA与传统的线性RNA不同，分子呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，富含微小RNA(micro RNA, miRNA)结合位点，可解除miRNA对其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表达水平，在疾病中发挥着重要的调控作用。circRNA数量庞大，通过寻找其调控通路中的关键基因节点对于探索妊娠期高血压的发病机制及制定妊娠期高血压治疗的临床策略具有重要意义和指导作用[4]。因此本研究挑选妊娠期高血压患者和正常妊娠的胎盘组织，采用lncRNA高通量测序筛选出2组样本间的差异表达circRNA，并根据生物信息学预测与其作用的靶基因。

1 材料与方法

1.1 组织样本收集 选取6名妊娠期高血压患者和6名健康孕产妇作为研究对象，分为妊娠期高血压组(M组)和健康对照组(C组)，各组的胎盘组织标本均于胎盘娩出后5 min内，在距离脐带附着点2 cm处的胎盘母体面同一部位取1 cm×1 cm×1 cm组织，无菌磷酸盐缓冲液冲洗后于液氮中保存备用。

1.2 纳入及排除标准 妊娠期高血压组纳入标准：(1)30～35岁的初产妇，且为单胎妊娠；(2)妊娠20周及以后孕期新发生的高血压，即收缩压≥140 mmHg和/或舒张压≥90 mmHg；(3)无其他基础疾病。排除标准：(1)胎儿发育畸形；(2)胎膜早破或羊水过多；(3)非自然受孕：(4)产后3个月内血压仍未恢复正常。健康对照组纳入标准：无其他基础疾病的30～35岁的初产妇，且为单胎妊娠，孕期血压正常。排除标准同妊娠期高血压组的排除标准(1)(2)(3)。

1.3 样本处理及RNA提取 (1)从每名产妇的胎盘组织中均取材0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm大小组织。将组内6名患者的样本加入至离心管内混合在一起后，向离心管内加入1.5 mL Trizon和0.3 mL氯仿，组织破碎仪以2 000次/分钟的频率破碎组织，冰盒上放置5 min。4 ℃、12 000 rpm离心15 min，把水相层转移到一个新的预冷1.5 mL RNase-Free离心管中。加入等体积预冷的70%乙醇，颠倒混匀后加入到已装入收集管的吸附柱RM中，在4 ℃，12 000 rpm离心30 s，弃去管内液体。加入700 μL RW1洗涤沉淀，4 ℃，12 000 rpm离心30 s，弃流出液。加入500 μL RW2洗涤沉淀。4 ℃，12 000 rpm离心30 s，弃去管内液体。随后离心2 min，使吸附柱内液体充分分离，冰盒上放置5 min，晾干。将吸附柱放入到一个新的1.5 mL RNase-Free离心管中，加入35 μL无RNase水后静置3 min，4 ℃，12 000 rpm离心1 min。得到的RNA保存在-80 ℃冰箱中，防止降解。(2)从M组和C组的RNA样本中各取15 μL，等分为3份，每份5 μL。按照试剂盒说明书将其反转录成cDNA。配置25 μL反应体系，反应条件为95 ℃预变性10 min，95 ℃15 s和60 ℃ 1 min共40个循环，然后0.3 ℃梯度升温用于熔解曲线分析。使用2-ΔΔCt方法计算相对表达水平。

1.4 高通量测序检测circRNA表达水平

1.4.1 分布特点评估 使用BWA-MEM软件将样本质控后的测序序列与参考基因组进行比对，然后采用CIRI2软件来鉴定circRNA，并使用BEDtools数据包根据circRNA的位置信息和基因注释信息来确定circRNA分布。

1.4.2 circRNA差异表达分析 每组样本设置3个生物学重复，先采用TMM软件对数据进行标准化处理，之后用DEGseq软件进行差异分析。为了得到显著差异的基因，将筛选条件设为：qValue<0.05且差异倍数|FoldChange|>2。

1.4.3 差异circRNA对应靶基因的富集分析 应用R软件的igraph package数据包，预测差异表达circRNA对应的宿主基因，并通过DAVAD软件将其进行基因本体论(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析，选取P值<0.05的通路进行展示。

2 结果

2.1 circRNA分布 以序列长度区分circRNA，可见长度在200～400 bp的circRNA分布较多；以包含外显子数量来区分circRNA，可见包含2～4个外显子的circRNA数量最多，分布情况见图1。

1A 长度分布情况 1B 外显子含量分布情况图1 circRNA分布情况

2.2 差异circRNA表达结果 2组样本共有43个差异circRNA，其中下调的circRNA有20个，上调的circRNA有23个。差异倍数最大的3个circRNA分别是circRNA00907、circRNA00427、circRNA00420。见表1。

表1 差异circRNA表达结果

续表1

2.3 靶基因GO富集分析 GO富集分析显示，主要富集的生物学过程为生物过程的正调控、细胞过程的正调控、多生物过程、生殖过程、白细胞激活；主要富集的细胞组分是胞外区、囊泡、膜的侧面、细胞表面、质膜外侧；主要富集的分子功能是信号受体结合、抗原结合、激素活性、免疫球蛋白受体结合、受体配体活性。见图2。

注：红色为主要富集的生物学过程，蓝色为主要富集的细胞组分，黄色为主要富集的分子功能图2 靶基因GO富集分析

2.4 靶基因KEGG通路富集分析 靶基因主要富集的信号通路中，仅氨酸激酶-信号转导与转录激活子(janus kinase-signal transducer and activator of transcription, JAK-STAT)信号通路的富集差异具有统计学意义，矫正后P=0.039。

2.5 JAK2和STAT3的mRNA表达差异 与C组比较，M组患者标本中JAK2的mRNA表达水平显著升高，差异有统计学意义(2.34±0.25 vs 1.02±0.18,P<0.05)；STAT3的mRNA表达水平显著升高，差异有统计学意义(1.56±0.21 vs 1.05±0.11,P<0.05)。

3 讨论

妊娠期高血压是一种不可预测的影响患者多个系统的综合征，与心血管并发症和糖尿病的高风险相关[5]。妊娠期高血压如果控制不佳，可迅速发展为危及生命的子痫。然而由于妊娠期高血压的病因仍未阐明，目前临床上对妊娠期高血压患者有效的治疗方法很少，唯一有效方法是分娩胎儿和胎盘，这可以减少母体心血管系统中的促炎物质[6]。妊娠期高血压的病理生理主要包括胎盘异常、螺旋动脉重构异常、胎盘功能不全和内皮功能障碍等。早发型妊娠期高血压与滋养细胞中螺旋动脉的生理转化改变有关，研究[7]显示，妊娠期高血压的胎盘常伴有胎盘梗塞和动脉硬化，从而导致胎盘灌注减低，而这与滋养层细胞浸润改变导致胎盘缺血相关。在健康妊娠妇女中，胎儿来源的绒毛外细胞滋养层侵入蜕膜和子宫肌层的螺旋动脉，随后这些螺旋动脉失去其内皮性质，从高阻力血管转变为大血管，能够提供足够的胎盘灌注，为发育中的胎儿提供营养[8-9]。但这种螺旋重塑在妊娠期高血压患者中常被破坏，由于螺旋动脉重塑受损，可导致胎盘缺血、缺氧，并有利于产生抗血管生成因子进入母体循环，从而导致内皮损伤[10]。目前，越来越多的证据支持滋养层浅表含义理论，即滋养层细胞侵袭功能障碍导致妊娠期高血压的发生和发展。随着基因组测序和基因芯片技术的发展，研究[11]发现人类基因组中可以翻译成蛋白质的基因仅占1%～2%，还有大量的不能转录成蛋白质的基因存在且在各种复杂的生物学过程中发挥作用，即非编码RNA，而circRNA就是其中的一种。研究[12]表明，circRNA的表达差异与滋养细胞的功能密切相关，提示其靶基因可能成为妊娠期高血压早期诊断和提示预后生物标志物，亦可能作为机制研究的突破口。

本研究发现共有43条circRNA存在表达差异，其靶向宿主基因的富集分析提示相关基因主要在细胞核外发挥作用，参与的生物学过程多与调控抗原与受体结合有关。富集的信号通路主要为JAK-STAT信号通路，它是近年来发现的一条由细胞因子刺激的信号转导通路，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程[13]，使得细胞外的化学信号跨越细胞膜并将信息传送到细胞核内DNA上的基因启动子上，最终引起细胞中DNA转录与活性水平发生改变，当JAK-STAT信号通路的功能失调可导致多种疾病。与其它信号通路相比，这条信号通路的传递过程相对简单，它主要由三个成分组成，即酪氨酸激酶相关受体、酪氨酸激酶JAK和转录因子STAT。JAK-STAT系统是除了第二信使系统外最重要的信号途径[14]。有研究[15]显示JAK-STAT信号通路的激活可能促进PE的发病，与本研究结果类似。

综上所述，本研究通过临床样本，检测了妊娠期高血压患者和正常产妇胎盘组织中circRNA的表达差异，并对其宿主基因进行了富集分析，为妊娠期高血压的发病机制研究提供了一定的参考。