H1foo在哺乳动物卵子发生和早期胚胎发育中的表达及功能研究进展

莫显红，郭 成，赵 冰，李 冰，徐振军

（赤峰学院 化学与生命科学学院，内蒙古 赤峰 024000）

真核生物染色质结构极为复杂，由细胞核DNA 与组蛋白结合形成的核小体为基本组成单位；以各两分子的核心组蛋白（H2A、H2B、H3、H4）构成的八聚体为核心颗粒，DNA 分子超螺旋盘旋在此核心颗粒表面形成核小体；两个相邻核小体之间以连接体DNA（linker DNA）相连。另一种组蛋白即连接组蛋白H1（linker histone，H1）与连接体DNA 结合，构成念珠状结构，对于维持染色质的高级结构及参与调节基因表达具有重要作用［1］。

过去，对核小体结构功能的研究主要集中于核心组蛋白成分研究，但连接组蛋白各亚型在染色质结构功能变化中的作用也不容忽视。至今在哺乳动物中已发现11种H1亚型。研究显示，一种卵母细胞特异性连接组蛋白（oocyte-specific linker histone，H1foo），对卵子及早期胚胎发育具有重要作用，因而成为一种衡量卵子质量和发育潜能的标志基因［2］，并将其作为调节转录活性及维持染色体高级结构稳定性的关键因子［3］。近年来，对H1foo 在卵母细胞成熟、精子染色质重构、早期胚胎发育、核移植后体细胞核重编程等过程中的作用进行大量研究，文章针对上述内容做一综述，以便为研究者了解卵子及胚胎发育的机制提供借鉴和参考。

1 H1foo的分子结构

目前在哺乳动物的细胞中共发现7 种体细胞型连接组蛋白、3种睾丸特异型连接组蛋白、1种卵子特异表达连接组蛋白H1foo。H1foo最初是在小鼠卵巢中发现的一种卵泡卵母细胞特异表达的连接组蛋白，曾命名为H1oo。而在一些非哺乳动物细胞中同样存在着卵特异表达的连接组蛋白，如海胆卵裂期组蛋白（cleavage-stage histone1，cs-H1）是海胆卵、合子及2-细胞胚胎之前唯一的连接组蛋白存在形式。相似地，在非洲爪蟾卵母细胞中早期表达的H1M（B4）蛋白作为主要的连接组蛋白与DNA结合［4］。这些卵特异表达的连接组蛋白在胚胎基因组激活后，逐渐被体细胞型连接组蛋白所取代。研究发现，哺乳动物卵特异性连接组蛋白H1foo与cs-H1及H1M（B4）具有同源性［5］，说明从原生动物到哺乳动物，H1保守存在。

2001 年，M.Tanaka 等［5］首次采用抑制消减杂交方法获得长1.2 kb 的cDNA 片段，包含912 个开放阅读框，编码304 个氨基酸，为相对分子质量34 kDa 的连接组蛋白，暂时命名为H1oo。2005年，M.Tanaka 等［6］又分别通过比对小鼠的基因组数据库及采用荧光原位杂交技术，分析得到小鼠的H1foo为单拷贝基因，由5 个外显子和4 个内含子组成，基因长度为5 301 bp，位于6号染色体上。此外，M.Tanaka 运用BLAST 技术进行氨基酸和蛋白质序列比对分析表明：H1oo 与H1M（B4）和cs-H1 的中央球形结构域的同源序列分别为54%和52%。进一步研究发现，H1foo通过可变剪接形成了H1fooα和H1fooβ两种转录本。两者之间区别在于H1foo β的C 末端插入了G、T、A、G 4 个碱基，引起阅读框改变，翻译提前终止，仅形成了一个含有246 个氨基酸残基的蛋白。虽然两种转录本在卵子及早期胚胎中均有表达，但H1foo β的表达量远低于H1foo α亚型。因此，H1foo α亚型即为H1foo转录后的mRNA。

随后，研究者分别在人、牛中也发现了卵特异性连接组蛋白，与小鼠H1foo基因同源。对3 个物种之间的H1foo同源性及保守的中央球形结构域进行氨基酸序列分析发现，三者之间具有较高的同源性，并且中央球形结构域的氨基酸同源序列高达71.4%［7］。

H1foo与体细胞型H1具有以下区别：基因的位置不同（小鼠和人的H1foo基因分别位于6 号染色体和3号染色体上，而体细胞型H1则位于13号染色体上）；内含子的基因结构不同，在小鼠H1foo基因第4 内含子处具有3 个A、G、G、T 重复区域；H1foo大多具有多聚腺嘌呤尾，而H1则不具有此结构。

2 H1foo 在哺乳动物卵子发生及早期胚胎发育中的表达

H1foo 是在哺乳动物卵母细胞中发现的一种特异性连接组蛋白，因此，H1foo 被认为是与卵泡生长、卵子成熟以及早期胚胎发育相关的主要H1组蛋白。目前，已有部分研究对哺乳动物卵母细胞和早期胚胎中H1foo 的表达变化模式进行了观察。

2004 年，Gao S. R.等［3］采用免疫荧光染色技术，最早在出生第8 天的小鼠原始卵泡中检测到H1foo的存在。进一步通过免疫荧光染色技术，在生发泡期（germinal vesicle，GV）卵母细胞、发生MⅡ阻滞（MⅡ-arrested）的卵母细胞、极体及合子期的雌雄原核中均可检测到H1foo的荧光信号，至2-细胞胚胎时此荧光信号开始减弱，最终在4-细胞胚胎期完全消失。而体细胞型H1 的表达模式与H1foo在不同细胞中的表达模式恰好相反，表明随着胚胎的不断发育，由母源基因控制逐渐向胚胎基因控制转变（即中囊胚转换期），胚胎基因组激活，母源H1foo 最终由体细胞型H1 取代。在牛上，通过定量RT-PCR 技术检测发现，在牛GV期卵母细胞中H1foomRNA的表达量最高，而在整个胚胎发育过程中，H1foomRNA 的表达量逐渐降低，至8～16-细胞时几乎不表达，牛的8～16-细胞正是中囊胚转换期，此时母源H1foo被体细胞型H1所取代［7］。

M.Tanaka等［6］采用原位杂交技术对小鼠不同发育时期的卵泡进行研究发现，在原始卵泡中H1foo 的杂交信号较弱，随着卵泡的不断发育，在初级卵泡、次级卵泡及排卵前卵泡卵母细胞中均检测到较强的H1foo 杂交信号，表明卵泡中H1foo募集和表达可能对促进卵母细胞的成熟具有重要作用。2013 年，袁苏娅［8］在研究产后小鼠不同发育阶段卵巢中H1foo的表达规律时发现，在各个时期的卵泡细胞和卵母细胞中均可检测到H1foomRNA 的转录物，随着卵泡的不断发育其转录量不断增加，且H1foo的免疫阳性反应物主要分布在卵母细胞的细胞核和细胞质之中。而在近成熟卵泡中，H1foo免疫阳性反应物除了在卵泡细胞和卵母细胞中可检测到外，在卵泡液中也可检测到；且H1foo的定位不仅仅局限于卵母细胞质和细胞核中，在卵泡液及靠近卵泡腔的颗粒细胞也有明显的表达，说明卵母细胞可借助细胞间连接与周围的颗粒细胞进行信息及物质的交换，以促进卵泡发育及卵母细胞成熟。采用免疫组化染色方法分析人的卵巢组织样本时发现，从原始卵泡到成熟卵泡任何阶段的卵母细胞中均有hH1foo（人卵子特异性连接组蛋白H1foo）阳性信号，其阳性信号不仅在细胞核中高度凝集，而且在细胞质中也有分布，这与小鼠上H1foo的分布结果一致［9］。在研究H1foo 在猪卵巢上的分布时发现，H1foo 主要分布在卵原细胞及凋亡的卵原细胞的胞质和不同发育阶段的卵泡及闭锁卵泡的卵泡液中，而在卵泡颗粒细胞也可检测到H1foo的阳性信号。并且，随着卵泡发育，在胞质和颗粒细胞中H1foo的阳性信号逐渐增强。因此推测在卵泡发育过程中，颗粒细胞通过H1foo 信号影响卵母细胞的发育［10］。同样，在体外培养牛的次级卵泡和有腔卵泡的研究中进一步证明，卵泡的生长发育与卵母细胞中相关基因的表达增加有关，H1foo基因是其中之一［11］。而在此后体外培养猪卵巢颗粒细胞的研究中，采用微阵列技术对颗粒细胞进行全基因组检测，在133个差异表达的基因中，H1foo却位列下调组，笔者分析可能是因为在颗粒细胞培养过程中没有卵母细胞的存在。卵巢是该基因表达和发挥功能的唯一部位，与卵巢之间的这种密切联系可能使其成为体外遗传标记基因［12］。

3 H1foo的功能

H1foo是一类与卵母细胞及早期胚胎发育密切相关的关键基因，其功能涉及转录控制、核重构、表观遗传修饰等，贯穿卵母细胞从原始卵泡到成熟卵泡、从GV向MⅡ发育成熟及受精后早期胚胎发育的全过程，被认为是这一过程中起主导作用的H1组蛋白。

3.1 H1foo在卵母细胞成熟和早期胚胎发育中的作用

有研究表明，卵泡中H1foo募集和表达对促进鼠卵母细胞的成熟具有重要作用［5］。M. Furuya等［13］在小鼠GV 期卵母细胞中注射反义吗啉代寡核苷酸（antisense MO）和对照吗啉代寡核苷酸（Control MO），经免疫荧光染色技术和Western-blot方法证实，注射antisense MO组H1foo的表达降低。然后将注射后的GV期卵母细胞体外成熟培养，经统计分析发现，注射antisense MO 组与注射Control MO 组相比，第一极体排出率差异显著（33.1%vs. 81.1%），大部分阻滞在第一次减数分裂中期（metaphase Ⅰ，MⅠ）。为进一步证实H1foo 在卵母细胞减数分裂过程中的作用，在注射antisense MO 的同时联合注射外源H1foomRNA，结果发现卵母细胞的成熟率显著提高。通过以上试验证实，H1foo在小鼠卵母细胞减数分裂过程中是必不可少的因素。

在牛上，S.McGraw 等［7］采用免疫组织化学技术检测H1foo的分布，发现H1foo在GV、MⅡ、1-细胞、2-细胞和4-细胞的细胞核中高度凝集，在胞质中均匀分布。而胚胎发育到8～16-细胞时，H1foo在细胞核中的表达信号仍然很强，但在胞质中不再表达。根据H1foo的分布位置，表明在胚胎基因组激活之前，H1foo 不仅参与调节染色质构象，还可能参与卵子发生和早期胚胎发育过程中基因的激活或抑制。Yun Y.等［14］分别通过siRNA 技术和注射外源H1foomRNA下调和上调牛GV期卵母细胞中H1foo的表达，与对照组相比体外成熟率具有显著差异（41.2% vs.88.7% vs.71.2%（对照组，P＜0.05），并且将修订的外源H1foocDNA 与siRNA组联合注射，成熟效果明显恢复。然而与对照组相比，体细胞型H1e过表达对牛卵母细胞的体外成熟效果无影响。综上结果表明，H1foo对牛卵母细胞成熟具有重要作用，且H1foo的过表达可能通过调节成熟促进因子的活性而加快减数分裂进程。

Jiao Z.X.等［15］在对比小鼠老龄卵和青年卵发育潜能的研究中发现，老龄卵的发育潜能下降，两者之间母源基因的表达存在差异，其中H1foo是差异表达的基因之一。综合H1foo在卵母细胞发育中的作用，越来越多的研究将H1foo作为衡量卵子质量和早期胚胎发育潜能的标志物。

2015 年，郎婧雯等［16］研究玻璃化冷冻小鼠卵母细胞对早期胚胎发育潜能和卵母细胞特异性基因表达的影响时发现，玻璃化冷冻-复苏这一过程使卵母细胞内H1foomRNA 及蛋白表达量显著下降，且体外受精后2-细胞胚胎发育率显著低于未冷冻组。已知H1foo 主要在小鼠的卵母细胞至2-细胞胚胎前发挥功能，在2-细胞后期H1foo 逐渐被体细胞型H1 取代［3］。因此，推测卵母细胞玻璃化冷冻可能通过降低H1foo的表达，进而影响其在受精至2-细胞胚胎这一发育过程中的作用发挥，致使2-细胞胚胎率下降。

3.2 H1foo参与精子染色质重构

卵子受精后，精卵各自独立的基因组经过一系列复杂变化，最终形成一个胚胎基因组，控制胚胎发育。精卵结合时，精子主要提供一半的遗传物质，而受精过程及早期卵裂所需要的物质和调控因子主要来源于卵子。在受精卵形成初期，父源基因和母源基因都处于转录不活跃状态，此时胚胎发育主要依赖于卵子发生过程中所积累的大量RNA和蛋白质。

研究表明，在哺乳动物卵子受精后即刻有H1foo募集到精子染色质上，这将有助于父源染色质的解聚及核重编程的顺利进行［17］。例如：在小鼠卵胞质单精子注射5 min 后，H1foo 就开始与精子染色质上的鱼精蛋白发生置换，改变染色质构象，对胚胎全能性建立起作用。在注射30 min、60 min后，H1foo已在解聚的精子染色质中显著表达［3］。同样，在猪的卵母细胞受精过程中也发现，在精子染色质解聚之前H1foo 就已募集到染色质上［18］。Y.Mizusawa 等［9］在对胞质内单精子注射后未受精的33 枚人卵子进行分析时发现，其中精子染色质凝集且未检测到hH1foo 阳性信号的占45%；精子染色质凝集且有hH1foo 阳性信号的占9%；精子染色质解聚且有hH1foo 阳性信号的占45%；无精子染色质解聚且未检测到hH1foo 阳性信号的情况。综上试验结果进一步说明，在精子染色质解聚之前，H1foo 已经进入染色质中，并且染色质解聚过程需要H1foo的参与。同时，这一试验结果也为寻找辅助受精失败的原因提供了有价值的参考。此后，S.Funaya 等［19］通过敲降和过表达的方法研究H1foo 在调节小鼠合子期染色质结构中的作用，再次证明H1foo是染色质解聚的必要条件。

3.3 H1foo参与核移植后染色质重构

细胞核移植技术主要是用来研究胚胎发育过程中细胞核和细胞质的功能以及二者间的相互关系，探讨有关遗传、发育和细胞分化等方面的一些基本理论问题。近年来，因其具有广泛的应用前景和巨大的应用价值而备受青睐。自成功获得克隆羊Dolly 以来，多种动物也陆续被成功克隆，然而该项技术仍然存在克隆效率低、流产率和死亡率高等问题，其应用潜力受到制约［20］。深入了解供体细胞核与受体细胞质之间的互作关系及重构胚的发育，将有助于加深对克隆机制的认识，进而提高克隆效率。

体细胞核移植是将已分化的体细胞核移入去核的卵母细胞中，而融合后的重编程能力是非常有限的［21］。研究表明，哺乳动物核移植过程中存在同受精过程相似的组蛋白替换，尤其是H1foo和体细胞型H1之间的替换，对基因的重编程具有重要作用。

在对小鼠体细胞核移植后组蛋白间的互换研究中发现，将卵丘细胞和成肌细胞的细胞核移入去核的MⅡ期卵母细胞中，融合后5 min内80%以上的细胞核中可检测到H1foo 的荧光信号；30 min后H1foo 的荧光信号增强，而体细胞型H1 荧光强度减弱；1 h后供体细胞核膜破裂，体细胞型H1完全被H1foo 替换［3］。T. Teranishi 等［22］以胎儿成纤维细胞核作为供体核移入小鼠去核的MⅡ期卵母细胞中，融合后10 min H1foo 即出现在供体核内；3 h 后，体细胞型H1 信号微弱。M.Becker 等［23］将胚胎干细胞核注入去核卵胞质中，获得与上述相似的试验现象。综上结果表明，H1foo不仅能进入细胞核中，而且能够组装到染色质上发挥作用，并可能存在H1foo 的胞质内蓄积或通过母源mRNA翻译而产生。对比以上3个试验结果，仅在融合后H1foo与体细胞型H1实现完全替换的时间略有不同，这可能与供体核类型有关。

在整个体细胞核移植重构胚早期发育过程中，H1foo的荧光信号出现在极体、假雄原核、1-细胞的细胞核中，2-细胞胚胎时，细胞核中H1foo 荧光信号明显减弱；至4-细胞胚胎，荧光信号完全消失，而体细胞型H1的表达趋势与此恰好相反［3，22］。这与受精胚胎早期发育过程中H1foo 与体细胞型H1此消彼长的变化趋势一致，即在小鼠胚胎发育的中囊胚转化期，H1foo再被体细胞型H1所替换。

与小鼠核移植后H1foo与体细胞型H1的替换速度相比，牛的体细胞型H1 被取代的速度较慢。在融合5 h 后H1foo 进入供体核染色质中，此时尽管体细胞型H1 仍有少量存在，但在融合8 h 后体细胞型H1 仍被H1foo 完全取代，表明在不同物种间，连接组蛋白的转化具有保守性［24］。

同样，两栖类动物卵特异性连接组蛋白B4 在体细胞核移植后的基因重编程中也发挥重要作用。J.Jullien 等［25］将维甲酸处理的胚胎干细胞核（多能性基因Sox2和Oct4表达受到抑制）移植到爪蟾生长的GV期卵母细胞中，在核植入24 h内可被100%重编程，多能性基因表达重新激活。随后，通过光漂白荧光恢复技术分析发现，在转录重编程之前，体细胞型H1丢失的同时伴有B4的融入。再通过抗体注射和阴性干扰试验，进一步证明B4与染色质的结合是核重编程的关键过程，是多能性基因重新激活的必要条件。N. Maki 等［26］在研究蝾螈色素上皮细胞转分化为晶状体试验中首次揭示，蝾螈细胞的转分化与体细胞核移植后核重编程有共同的机制，B4是转分化过程的必要条件。

3.4 H1foo的其他功能

随着H1foo功能的不断揭示，研究者更应关注寻 找 调 控 其 表 达 的 机 制。C. Maeda 等［27］研 究H1foo的表达与表观遗传修饰的关系时发现，在各类细胞中H1foo 表达与否与上游差异甲基化区域（differentially methylated region，T-DMR）的甲基化状态直接相关。此外，H1foo在胚胎干细胞向拟胚体发育过程中有阻碍作用。研究表明，H1foo选择性地与某些多能性基因的低甲基化T-DMR 位点结合，通过改变染色质的凝集状态，最终改变多能基因的甲基化状态，破坏了胚胎干细胞的多能性。基于H1foo在表观遗传调控中的作用，作者将H1foo定义为“表观遗传调控因子”［28］。

4 展望

目前，对H1foo的研究还仅局限于本身的表达变化及其在各个发育环节中的功能。然而，对调控H1foo表达的上游机制和H1foo影响的下游因子的研究尚缺乏，人为干预H1foo表达后的受精率及核移植效率仍不够理想。若能对H1foo表达的上下游调控机制加以深入研究，或通过构建H1foo真核表达载体pVenus-H1foo，将为探明哺乳动物早期胚胎发育机制和克隆机理提供全新的视角。