反刍动物瘤胃纤维降解微生物的研究进展

朱相德,李娅楠,徐晓锋

(宁夏大学 农学院，银川 750021)

纤维素作为植物细胞壁的主要成分，是环境中含量最丰富的可再生有机化合物之一[1]。它是由成百上千个葡萄糖单元通过β-1，4-糖苷键连接的线性聚合物组成的[2]。不同的调查估计，全球每年的纤维素产量为1011～1012t[3]。反刍动物瘤胃是一个由细菌、古菌、原虫和真菌组成的复杂的微生物生态系统[4]。且每毫升瘤胃液估计含有约1010个细菌，其中约10%是纤维素分解细菌[5]。研究发现，降解纤维素的细菌主要有：产琥珀酸丝状杆菌、白色瘤胃球菌、黄色瘤胃球菌、溶纤维丁酸弧菌[6]，降解纤维素的厌氧真菌包括：厌氧肠真菌[7]、新孢子菌属、环孢霉菌属等[8]。这些纤维降解微生物能够降解纤维素产生乙酸、丙酸、丁酸等挥发性脂肪酸(VFA)为反刍动物提供能量[9]。因此，研究瘤胃纤维降解微生物对纤维素的降解机制并提高纤维素利用率具有重要意义。本文从瘤胃纤维降解微生物对纤维物质的降解、瘤胃纤维降解微生物的分离筛选及瘤胃纤维降解微生物的调控作一综述，旨在为瘤胃纤维降解微生物的理论研究提供参考。

1 瘤胃纤维降解微生物的降解作用

1.1 纤维素酶

植物性饲料大多含有较高纤维素，其在瘤胃中降解时需要纤维素降解微生物分泌的酶来催化。纤维素酶实质上是由多种酶组成的复合酶[10]主要包括三类：(1)内切-β-1,4-葡聚糖酶简称为内切酶，随机切割纤维素多糖链内部的无定形位置，产生不同长度的寡糖，从而产生新的链端[11]。(2)外切-β-1,4-葡聚糖酶简称外切酶，作用于纤维素多糖链的还原端或非还原端，释放出的产物主要是葡萄糖或纤维二糖，也可作用于微晶纤维素。(3)β-葡萄糖苷酶，水解可溶性纤维糊精和纤维二糖为葡萄糖[12-15]。在纤维素降解过程中，这三种酶协同完成降解任务。

1.2 瘤胃纤维素酶基因的多样性

反刍动物瘤胃微生物能够分泌各式各样的酶，挖掘瘤胃这一高效纤维降解系统的重要途经就是研究纤维素降解酶基因表达的多样性及酶诱导调控。随着测序技术的不断发展，研究者们采用宏基因组学技术对瘤胃纤维素酶基因的多样性进行研究。Hess等[16]采用宏基因组技术对奶牛瘤胃微生物进行了测序, 共鉴定了27 755 个碳水化合物活性酶基因, 并有90个候选蛋白表达，其中57%的能降解纤维素。 这些基因的发现为以后发掘更多新型的纤维素酶开辟了道路。Javad等[17]在骆驼瘤胃中发现66 个较完整的基因组，其中拟杆菌含有较高比例的脱支酶和寡糖降解酶基因，厚壁菌和纤维杆菌门富含纤维素酶和半纤维素酶基因，显示出极高的多样性。张慧敏等[18]对海子水牛进行宏基因组测序发现具有木质纤维素降解能力的蛋白质是由38 011 个基因所编码, 其中糖苷水解酶 (GH) 基因数量最多 (17 877 个) 、 糖基转移酶 (GT) (8 637 个) 、碳水化合物结合模块 (CBM) (4 693 个) 和碳水化合物酯酶 (CE) 基因 (4 214 个) 数量次之, 多糖裂合酶 (PL) (1 296 个) 和辅助氧化还原酶 (AA) 基因 (934个) 数量较少。且研究发现糖苷水解酶家族(GHs)5、6、7、8、9、10、12、44、45、51、61和74具有纤维素水解活性[19]。其中GH7家族纤维素酶主要集中于整个内切纤维素酶系中，GH5家族中纤维素酶种类较为多样[20]， GH6和GH7家族中外切葡聚糖酶含量丰富[21]，β-葡萄糖苷酶多在GH3家族[22]。总之，瘤胃中存在大量还未挖掘的纤维素酶基因，如果能将其分离并在工程菌中表达将极具应用前景。

1.3 纤维素酶降解纤维素的作用机制

纤维素酶降解纤维素的作用机制目前未有定论，不同研究者的观点有一定的分歧。主要理论有：1950 年，Reese等[23]提出的C1-Cx假说，即结晶纤维素首先被C1酶(外切葡聚糖酶)作用变为无定形纤维素，再通过Cx酶(内切葡聚糖酶)的水解作用将无定形纤维素转变为纤维二糖，最后纤维二糖被进一步水解为葡萄糖。Enari等[24]提出的顺序作用假说，即首先纤维素被外切葡聚糖酶降解为可溶的纤维糊精和纤维二糖，然后由内切葡聚糖酶将可溶性物质全部转变为纤维二糖，最后β-葡萄糖苷酶降解纤维二糖为葡萄糖。目前更受关注的有关纤维素降解的协同理论，其具体内容为：首先内切葡聚糖酶切割纤维素，释放了自由链末端；然后这些末端被外切葡聚糖酶降解，当它们沿着链移动时会释放纤维二糖，最后β-葡萄糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖[10]。

1.4 纤维小体

可分解纤维素的厌氧细菌能够产生一种多酶复合体--纤维小体(cellulosome)，用于降解木质纤维素[25]。纤维小体是由支架蛋白的粘附素模块和各种多糖降解酶的Dockerin (对接蛋白)模块之间的蛋白质相互作用形成的超分子多酶复合体[26]。Lamed等[27]首次发现其存在于超嗜热厌氧微生物热纤梭菌 (clostridium thermocellum) 中并鉴定, 分子大小为2×106～6×106u, 由14～50个亚基组成。在瘤胃四种主要的能够降解纤维素的细菌中黄色瘤胃球菌是唯一已知的通过产纤维素酶进一步组装成纤维小体去降解纤维素的细菌[28]。从它的基因组草图中发现223个含有Dockerin的开放阅读框。这是在梭状芽孢杆菌中观察到的纤维小体的组分的三倍，使其纤维小体成为迄今为止最复杂的结构[29]。白色瘤胃球菌的糖苷水解酶蛋白缺少Dockerin[30]，表明它的糖苷水解酶蛋白只保留在细菌细胞表面，并没有形成真正的纤维小体，而是通过碳水化合物底物被碳水化合物连接域黏附来开展分解活动[31]。厌氧真菌的的纤维小体与厌氧纤维降解细菌的纤维小体有许多相似的性质和结构，也是酶通过真菌的Dockerin连接到支架蛋白上，但它们的结构在氨基酸序列上有所不同[32]。

1.5 厌氧真菌对纤维物质的降解

厌氧真菌属于新丽鞭毛菌门[33]。虽然它们在瘤胃中含量较低，但由于其有多糖降解酶库[34]，因此在饲料植物结构性碳水化合物的降解中发挥重要作用[35]。其从两个方面降解纤维素，第一，厌氧性真菌存在丰富的假根系统，通过其穿透作用促使瘤胃内的纤维素疏松；第二，厌氧性真菌在瘤胃体内分泌出纤维素酶将已经被疏松的纤维素分解成VFA，最后VFA被动物直接吸收[36]。

2 瘤胃纤维降解微生物的分离筛选

随着16S rRNA测序分析技术和ITS区高通量测序技术的广泛应用[37]，人们对瘤胃微生物有了更加全面的认识。为了研究单个菌落的降解特性，研究者借助Hungate滚管法[38]和选择培养法[39]，已经分离筛选出了多种具有纤维降解能力的细菌及真菌。Sari等[40]在亚齐牛瘤胃瘤胃液中分离出了一种纤维素降解菌，经鉴定其可能是肠杆菌科的一个新种或另一个属；韦海婷[41]从梅花鹿瘤胃中分离出了蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌两株纤维降解菌； Aihemaiti[42]从新疆绵羊、牛、骆驼的瘤胃液中分离出84 株纤维素降解菌株，其中40 株表现出较强的纤维素分解能力。其中革兰氏阴性菌株37 株，革兰氏阳性菌株3 株。

Orpin[43]于1975 年首次证明了厌氧真菌在瘤胃中是存在的。随着研究的不断深入，Sun[44]采用Hungate滚管法分离了28 个纤维素分解厌氧真菌与产甲烷菌共培养的菌株；Resende[45]从荷斯坦奶牛瘤胃中分离了12 株能够降解木质纤维素的真菌菌株；李敏[46]采用体外亨氏滚管培养技术，从绵羊瘤胃液中分离得到3 株具有纤维降解能力的厌氧真菌，经鉴定其为Neocallimastix属菌，Piromyces属菌和Cyllamyces属菌；Wei等[47]从青藏高原放牧牦牛瘤胃中分离到20 株真菌-产甲烷菌共培养物。

近年来，兼性厌氧菌也相继被分离出来。李君风[48]从牦牛瘤胃中分离出具有分解纤维素能力的兼性厌氧菌，经鉴定为粪肠球菌；李润泫[36]在野生动物牦牛瘤胃液中也筛选出17 株具有纤维降解能力的兼性厌氧细菌；吕宗浩[49]从奶牛瘤胃液中采用羧甲基纤维素钠平板法筛选出了特基拉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等15 株兼性纤维素分解菌。

3 瘤胃纤维降解微生物的调控

瘤胃中纤维物质的降解任务是由瘤胃纤维降解微生物所执行，主要是细菌。因此，优化激活瘤胃纤维降解微生物是非常重要的[50]。影响反刍动物瘤胃微生物菌群发生变化的主要因素是饲料的组成及其本身的性质[51-52]。研究者通过改变饲粮性质、种类、调制方法以及添加各类添加剂的手段来调控瘤胃纤维降解微生物，以促进纤维降解微生物种群的生长和活性，改善饲料的消化。调控效果的评价指标包括纤维消化率以及瘤胃细菌丰度和活性[50]。

3.1 碳水化合物的调控作用

反刍动物瘤胃微生物的能量主要来源于瘤胃微生物对碳水化合物降解所产生的能量。日粮中碳水化合物的组成和比例变化会导致瘤胃纤维降解微生物的群落的变化[53]。而碳水化合物对瘤胃纤维降解微生物的影响研究主要集中在非纤维性碳水化合物(NFC)与中性洗涤纤维(NDF)之间的比值对瘤胃纤维降解微生物纤维降解能力的影响研究。

普宣宣等[54]研究发现，卡拉库尔羊瘤胃纤维降解菌、半纤维素降解菌分别在NFC/NDF为0.96、1.37时相对丰度最高；营养物质的消化率在NFC/NDF为1.37时得到提高；还发现，NFC/NDF为0.96时纤维素酶活性最高，比例提高酶活反而降低[55]。Song等[56]研究发现，产琥珀酸丝状杆菌的丰度随着NFC/NDF比值的升高而显著降低。高NFC/NDF比增加了瘤胃总VFA的产生，尤其是丙酸，降低了乙酸，从而降低了乙酸与丙酸比，降低了纤维素酶和木聚糖酶活性。造成上述结果的原因可能是NFC在瘤胃中降解速度快并产生了大量的乳酸和丙酸，使瘤胃pH下降，而pH值过低会使瘤胃纤维降解微生物的生长受到抑制和降低纤维素酶活[57-58]。以上研究表明，碳水化合物通过改变瘤胃发酵模式、改变瘤胃内环境来影响纤维降解菌的增殖和纤维素酶活，从而影响反刍动物对营养物质的消化。因此，饲粮中碳水化合物的结构比例对反刍动物意义重大。

3.2 饲料加工的调控作用

饲料加工对瘤胃纤维素降解微生物影响的研究成果更容易在生产上实现，因此研究者们也积极在此方面进行了研究。陈青[59]研究发现，瘤胃纤维降解菌的含量随着通过羊草长度改变实现的物理有效中性洗涤纤维(peNDF)水平的适当增加而增加，提高了pH和改善瘤胃发酵。于满满[60]研究发现，不同比例氨化玉米秸秆和苜蓿组合均会降低发酵瘤胃液中黄色瘤胃球菌和瘤胃原虫的相对数量，而真菌、白色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌成为优势菌群。比例为20∶80时乙酸和总VFA浓度最高。辛杭书[61]研究发现，氨化和碱化处理的水稻秸秆在体外培养24 h后培养液中产琥珀酸丝状杆菌的相对数量显著提高，72 h后，显著增加了总VFA浓度。总体而言，适当的饲料加工方法对瘤胃纤维降解菌具有积极的调控作用，能通过增加纤维降解菌的数量和组成来提高对饲料纤维物质的消化。

3.3 添加剂的调控作用

添加剂对纤维素降解微生物影响的研究涉猎较广，包括多种添加剂对纤维降解微生物的影响。Sousa等[62]给全年放牧的尼罗尔牛添加活性酵母，结果表明，补充活性酵母能使纤维降解菌受益，并提高放牧动物的纤维消化率，且不受季节的影响。Mamuad等[63]添加0.1%的粪肠球菌，改变了微生物群落的丰度和组成，瘤胃内细菌总数和黄色瘤胃球菌的数量最高，显著提高了丙酸和总VFA浓度。Kido等[64]研究了添加低聚纤维糖(Cellooligosaccharides, CE)对放牧犊牛生长性能的影响。结果表明，添加CE对断奶犊牛瘤胃微生物组成中纤维分解菌比例的增加有所帮助，且平均日增重(ADG)高于未添加组的。Zhou等[65]在山羊精料中添加不同水平的胡椒提取物(Piper sarmentosum extract , PSE)，结果表明，添加PSE后不同处理间黄色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌的含量不同，且浓度在1 200 mg/kg时含量最低。降低了瘤胃乙酸、戊酸浓度和乙酸/丙酸比值。徐晓锋[66]研究发现，添加甘露寡糖能够缓解因饲喂大量淀粉导而致的纤维降解菌丰度的下降，对瘤胃纤维降解能力的恢复有一定的促进作用。

综上所述，不同添加剂会对反刍动物瘤胃纤维降解微生物产生不同程度的影响，从而影响瘤胃发酵、纤维消化及生长性能等。并且随着抗生素的禁用，开发新的添加剂显得尤为重要，但要考虑添加剂的功能、特性以及添加量等。

4 展 望

长期以来，人类在探索反刍动物瘤胃方面付出了很多努力，并在从中收获了很多经验、研究方法以及新技术。目前对于瘤胃纤维降解微生物的研究包括两个方面：一个方面是通过分离优势单菌研究其降解特性以及添加不同添加物对其增殖的影响；另一个方面是以瘤胃为整体研究对象，通过测序技术来研究日粮组成对其丰度的影响，并添加不同添加物对其进行调控。但这些研究并未完全掌握其作用规律，因此笔者建议未来研究可以将宏基因组学、宏转录组学、宏蛋白质组学以及代谢组学等技术关联起来，揭示瘤胃纤维降解微生物的代谢规律、作用机制、调控规律等。这样人们可以更全面的认识瘤胃纤维降解微生物并利用其代谢规律来合理搭配饲料从而提高粗饲料资源的利用率。