芦苇属植物的分子生物学研究进展

卓 蕾，向成丽，何昌杰，吴章桥，叶媛丽

（西南科技大学生命科学与工程学院/四川省生物质资源利用与改性工程技术研究中心，四川绵阳 621010）

芦苇（Phragmites communis）为禾本科芦竹亚科多年生水生或湿生植物，是我国分布较为广泛的植物资源，多生于江河湖泽、池塘沟渠沿岸等低湿地[1]。芦苇以其迅速的繁殖能力，形成连片的芦苇群落，是造纸和建棚的原材料。芦苇应用广泛，除用作原料外，其根状茎可供药用[2]，也可作饲料。同时，芦苇属植物根茎四布，有固堤之效，丰富的通气组织有净化污水的作用，是植物界中集经济价值和生态价值于一身的典型代表，备受人们关注。

长期以来，人们对芦苇的研究主要集中在地理分布[3]、生态型划分[4]、形态变异[5]和生理响应[6]等方面。近年来，随着分子生物学技术进步，国内外学者将分子生物学技术应用到芦苇研究中，取得了一些重要进展，为揭示芦苇属植物生长发育、代谢调控机制等奠定了重要的分子基础。现就芦苇分子生物学方面的最新研究进展进行论述，以期为该领域的深入研究及开展芦苇资源的合理利用提供参考。

1 克隆多样性和遗传多样性

芦苇克隆种指由同一个祖先通过无性繁殖形成基因型相同的所有子代组成的群体，常用克隆多样性表示种群内遗传变异程度，而用遗传多样性表示种群间的遗传分化程度。多样性分析如果仅着眼于芦苇形态特征，往往会低估形态相似群丛的多样性，而高估由环境差异造成形态差异显著群丛的多样性。随着DNA 分子标记技术应用于芦苇属植物，度量种群的克隆多样和遗传多样性变得更为准确可靠。

1.1 全基因组分子标记

近年来，传统的分子标记（诸如RAPD、ISSR、SSR等）均在芦苇属植物上得到应用，也有不少研究者结合多种分子分析标记或分子标记结合传统遗传标记综合分析。杨晓杰等[7]利用ISSR 标记对扎龙野生芦苇多样性进行分析，结果显示，ISSR 标记特异性强、稳定性好、多态性高，适用于芦苇的遗传分析。分析得出该地芦苇变异程度高，变异来源主要是居群内，说明地理位置距离近的芦苇遗传不一定相似。林文芳等[8]采用ISSR 与RAPD 结合的方式对河西走廊4 种不同生态型芦苇进行综合分析，2 种分子标记所得数据具有正相关性，因此彼此间可以相互验证结果的可靠性。此外，结合土壤盐分因子和水分因子分析，不同生态型之间产生了由水生经盐渍向沙丘进化的变异趋势。综合以上研究成果，结合芦苇属植物在不同生境的长期适应中易形成不同生态型的特性可以粗略得出，环境因子对芦苇遗传多样性的影响大于地理距离的影响。而得出地理距离近者遗传相似度高这一结论有可能是因为该研究地地理位置近的区域恰好生境相似度高，从而造成了相关性因子归纳错误。张俪文等[9]对此做出了验证，其利用另外一种分子标记——SSR 标记研究遗传变异与地理距离、生境盐度的关系，结果显示，群体间遗传多样性与地理距离无关，而与生境的盐度具有正相关。此外，Li 等[10]采用AFLP 与SSAP 分子标记对中国松嫩平原4 个不同生境芦苇进行了遗传变异研究，结果表明，遗传多样的聚类与地理聚类一致，进一步对同一克隆群体内私有条带同源性分析表明调控基因和反转录因子可能在芦苇生态适应和分化中起重要作用，而这一作用受到外界环境的影响。还有研究者进一步研究环境胁迫因子是否会产生遗传水平的变异，如邓仕槐等[11]采用RAPD 标记揭示在畜禽长期高浓度污染胁迫下，芦苇的DNA 水平发生变异。Gao 等[12]发现盐碱生境镶嵌中芦苇自然种群表现出明显遗传变异，而从芦苇的繁殖特点来说，芦苇属植物属于典型的无性繁殖植物，只有在种群形成初期才会进行有限的有性繁殖，理论上种群内的遗传变异小，但研究证明芦苇居群具有高水平多样性，原因可能是多种环境因子介导了芦苇的遗传分化，研究结果也表明了遗传多样性与生境异质性的强烈关联。

1.2 叶绿体基因组分子标记

叶绿体分子标记是研究芦苇属植物遗传多样性、系统发育的重要工具。胡思文等[13]利用叶绿体DNA rpl16 基因序列为引物扩增目标基因，对扩增产物进行DNA 测序和拼接，最后进行遗传分析得出长江中下游芦苇变异程度低于云贵高原，而两者居群间的分化程度都较居群内更高。此外，还基于rpl16 基因序列构建了系统发育树，说明不同地理区域之间的芦苇样品有较高分散性，可以分为2 个单系。而龚晓洁等[14]利用叶绿体matK/trnK 基因序列，构建3 个严格一致的系统发育树，对芦苇进化方向提出了分子水平的证据支持，即水生芦苇是最古老的类群，盐渍过渡型芦苇属于中间过渡类群，最终向沙漠型芦苇发展，这与林文芳[8]研究结果一致。

2 表观遗传学

表观遗传是指基因表达通过修饰发生变化而DNA 序列本身不发生改变的现象，包括以DNA 甲基化和组蛋白修饰影响基因转录和以RNA 修饰影响翻译2 种。此现象受到外界条件的调控，并在生物体众多重要的生命过程中起关键作用。研究芦苇属植物受多种环境胁迫后的表观遗传反应，有利于对该属植物在污染环境下的正常生长、生存及生产能力作出判断，以期更好开发其治理污染的能力。目前对芦苇属植物的表观遗传学研究仍处于起步阶段，主要集中在利用DNA 甲基化修饰对遗传多样性及遗传结构进行分析。石奔[15]采用DNA 甲基化敏感多态性技术研究中国嫩江平原上芦苇多样性，该研究证实了MSAP 技术适用于芦苇植物，并且从DNA 甲基化水平分析得出该地芦苇由环境差异导致的遗传变异程度高，其中除土壤盐碱度参与芦苇种群间的表观遗传分化外，还有其他环境因素对其产生影响。邱天[16]借助相同的方法研究2种生境下的芦苇，结果表明，芦苇存在广泛的DNA 甲基化，甲基化敏感位点中多态位点所占的百分比较高，基于此分析得出生境间表观遗传分化达到了极显著水平（P＜0.01）。Spens 等[17]研究发现，引入亚种和天然亚种之间的表观遗传特征有显著差异，并且发现引入亚种比天然亚种表现出更多的表观遗传变异，这给引入的亚种带来竞争优势。

3 功能基因研究

研究芦苇属植物功能基因是揭示芦苇属植物生长发育、代谢调控机制的重要途径。目前，芦苇属植物功能基因的研究主要集中在抗逆基因、金属脱毒相关基因等。

3.1 基因文库构建和转录组分析

获得高质量的高分子量核DNA（HMW-DNA）是构建基因文库的前提。杨俊等[18]基于前人的研究，对Zhang 等[19]的传统方法进行改进，诸如在研磨时在细胞核提取液中加入4%PVP-40、2%PPVP 以避免多酚类物质氧化，为更有效去除细胞器对DNA 的干扰，将缓冲液中TritonX-100 浓度由0.5%增加到0.75%的改良。结果获取的HMW-DNA 经酶得到的DNA 片段完全符合构建BIBAC 文库所需的条件。此研究为耐盐芦苇的大片段DNA 遗传转化奠定了基础，为转基因获得耐盐作物提供了新的思路。高鸿等[20]利用杨俊的方法，构建耐盐芦苇不同大小的片段DNA-BIBAC 载体，经根瘤农杆菌介导，成功转化了粳稻成熟胚愈伤组织，获得了转基因耐盐水稻植株。经实验总结得出，插入的DNA 片段越大转化效率越低。此外，肇莹等[21]首次利用SSH 技术对通过花粉管转导芦苇总DNA 的变异水稻构建cDNA 文库。结果表明所构建的文库质量良好，通过RT-PCR 技术进一步验证了芦苇总DNA 转导到水稻中，能使水稻获得了抗盐性。综上，尽管利用基因工程技术将特定外源基因导入作物后，一定程度上提高了作物的耐盐能力，但耐盐性是受多数数量性状基因控制的复杂性状，单个基因片段的转化对提高作物耐盐性作用有限。因此，只有同时转化多个耐盐基因，或将耐盐植物总DNA 转入作物中，才能大幅提高作物耐盐性。

3.2 功能基因克隆及鉴定

传统的植物修复策略通常是在被污染环境中寻找超富集植物，但这样耗时耗力，且寻找到的修复植物生物量小、修复能力弱、生长周期长、修复成本高，具有一定的局限性。利用转基因技术将重金属富集相关基因转入高生物量植物，通过异源表达产物可介导转基因高生物量植物积累重金属。植物络合素基因合成的多肽，能鳌合重金属，让植物具有富集金属能力而不致植物自身死亡。赵翠珠[22]采用RACE-PCR 技术，从芦苇中分离了植物络合素基因，并构建了表达载体转入Cd敏感型酵母菌株中。在100μM CdCl2胁迫下，试验结果表明，转基因酵母生长情况好于非转基因，说明过量表达植物络合素合酶提高了酵母细胞对Cd 的抗性。随后研究者又分别构建载体，尝试转化高生物量的优良草坪草剪股颖和高羊茅，为进一步大规模修复重金属污染土壤奠定了基础。此外，植物具有较强的抗逆性，能在被污染的环境中生存是植物修复的前提，研究者们也对芦苇抗逆基因进行了研究。如Takahashi 等[23]从盐敏感型和耐盐型芦苇植物中分别分离出钠/氢反向转运基因，然后转入酵母菌进行表达，在高浓度盐离子胁迫下，转入耐盐型芦苇基因的酵母比转入敏感型芦苇基因酵母生长好，进一步分析得出前者酵母细胞中钠离子含量不到后者的1/2，说明耐盐型芦苇钠/氢反向转运基因从细胞中排除钠离子更有效，为后续的基因功能开发提供了理论基础。

4 蛋白质组学

早在1994 年，赵相山等[24]就对沼泽芦苇和沙丘芦苇叶中提纯的Rubisco 进行比较分析，发现芦苇在长期适应沙丘生境的过程中，发生了Rubisco 亲水性氨基酸相对含量增多，SH 基含量大幅降低的适应性变化。研究从蛋白质分子水平阐明了沙丘芦苇光合速率较低的本质是Rubisco 酶活性降低，在一定程度上可以作为划分不同生态型的遗传依据。随后，李卫霞[25]利用免疫学方法分析水生、沙生芦苇Rubisco 蛋白差异，结果表明其免疫学差异较小。林文芳[26]运用了蛋白组学技术结合生物信息学分析方法，对叶片全蛋白及叶绿体亚蛋白组进行比较分析，结果显示，差异显著的蛋白质位点较多，水生和陆生芦苇某些蛋白表达丰度差异大，且与环境呈现相关性。

5 展望

芦苇是全球广泛分布的多型种，因其广泛的环境适应能力及强大的污染治理能力，一直以来备受人们关注。利用分子标记开展芦苇遗传多样性分析研究取得了喜人的成绩，为种质资源的保护及合理利用提供了理论指导。芦苇属植物功能基因和蛋白质组的研究起步相对较晚，研究内容有限，后续可运用第三代测序技术结合生物信息学，大规模发掘基因资源，也可运用双向电泳技术、质谱分析技术对蛋白质组全面分析，从而揭示芦苇生长发育、代谢调控机制，这将促进芦苇属植物资源的新兴利用方式的开发。