纳米自组装短肽RADA16在医学中的应用研究与进展

高露瑶，敖弟书，宋鸿

(遵义医科大学微生物学教研室，贵州 遵义 563006)

分子自组装是生物体中普遍存在的一种现象，它不受外力影响便可自发聚集、组装形成稳定结构。1993年Zhang等[1]在研究酵母Z-DNA结合蛋白Zuotin时发现了一种在水溶液中异乎寻常自组装成纳米纤维的短肽EAK16-Ⅱ，在此基础上，相继发现与合成许多纳米自组装短肽材料。自组装短肽RADA16是利用“bottom-up”(自底向上)原理，采用自然界已有分子构件，通过分子与分子间的相互作用自组装形成的一种新型生物材料。RADA16具有独特的氨基酸序列(Ac-RADARADARADARADA-CONH2)，在生理盐溶液条件下可通过非共价键作用自发形成具有亲水面和疏水面的β-折叠结构，最终自组装形成含水量超过99%的纳米纤维水凝胶[2]。相比于其他生物材料，RADA16不仅具有含水量高、生物相容性良好、可降解等优点，还可根据需要进行化学修饰，在医学、生命科学领域具有良好的应用潜力[3-4]。据此，本文就纳米自组装短肽RADA16在细胞培养、药物缓释、再生医学等方面的应用作一简要综述。

1 细胞培养

近年来，细胞三维(three dimensional, 3D)培养研究日益增多，培养技术日渐成熟。在既有的细胞3D培养方法中，利用载体(3D支架)进行细胞培养是最常用的一种培养方法。选用恰当的细胞支架，将为细胞的黏附、增殖、分化及细胞间相互作用提供更为适宜的空间微环境。

天然细胞外基质(extracellular matrix, ECM)主要由凝胶样基质和纤维网架构成，为精密有序的网络结构，而短肽RADA16在离子条件下可自组装形成孔径5～200 nm的纳米纤维网格结构，其孔隙度与天然ECM相似[2]，同时其氨基酸序列设计中RAD(精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸)序列与细胞膜上整合素的配体结合位点RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)多肽序列相近，这就为细胞黏附生长提供了类似于天然ECM的3D培养环境，有利于细胞的黏附、增殖和分化[5-6]。而相比其他3D培养材料，如机械性能和细胞黏附性较差的藻酸盐等有机材料复合物或动物来源的可能含有残留生长因子甚至不确定成分的胶原、Matrigel等基质凝胶[7-8]，生物相容良好的纳米自组装短肽RADA16还具有成分纯净、无免疫原性等特点，这亦为细胞在支架中的生长提供了更为有利的生存条件。因此，RADA16是一种理想的细胞培养支架材料。目前，在细胞3D培养领域，RADA16多集中于癌细胞培养或干细胞培养。早年Kakiuchi等[9]证实将人类粒细胞白血病HL-60细胞培养于0.01%RADA16水凝胶中时，细胞可经诱导分化成单核细胞/巨噬细胞。而将小鼠的胚胎干细胞(R1细胞)和诱导性多能干细胞(TTF-1细胞)培养在该支架中时，发现支架中的干细胞多巴胺能神经元分化较普通二维(two dimensional, 2D)培养显著增加，且这些分化的神经元能表达特定的多巴胺能标志物[10]。同样，证实RADA16可用于皮下脂肪源性祖细胞的3D培养，在心脏诱导分化培养基作用下，细胞在RADA16水凝胶中呈簇聚集生长，同时表达相应的心脏发育标志物(如GATA14、TBX5、MEF2C、ACTN1等)[11]。在卵巢癌A2780细胞的体外3D培养中，RADA16作为良好的生长支架供其黏附、增殖以及表达相应的细胞黏附分子和血管生成因子[12]。

纳米自组装短肽的另一大优势特点是其结构的可修饰性。随着研究深入，研究者们设计利用不同的功能肽序列来对短肽RADA16进行改造，进一步优化其性能和运用。神经营养因子(BDNF)的衍生肽(序列RGIDKRHWNSQ)与RADA16的C端连接形成新的RADA16-BDNF三维肽支架，将人脐带间充质干细胞与活化的星形胶质细胞共培养于该支架中，不仅可促进典型的神经元样细胞分化，同时还能减少脑损伤周围的反应性胶质增生[13]。将连接了功能序列的RADA16-RGD水凝胶与RADA16进行混合，并用于小鼠胚胎成骨细胞前体MC3T3-E1细胞的培养，结果表明该混合培养的方式可促进细胞黏附、增殖和成骨分化[14]。Luo等[15]将转染了人神经源性营养因子(hBDNF)的骨髓间充质干细胞培养于修饰了功能基序PRG的RADA16短肽水凝胶中时，发现无论是细胞增殖活性、hBDNF蛋白表达，还是神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白的表达均高于单纯用RADA16短肽水凝胶培养细胞的实验组。

材料科学、组织工程、细胞生物学等学科的技术进步推动了细胞3D培养技术的发展。到目前为止，纳米自组装短肽RADA16及其衍生材料已用于培养多种不同的组织和细胞系，与2D细胞培养相比，其3D细胞培养技术是一项相对较新的技术，但应用于临床模型的研究目前仍较少。

2 药物/蛋白缓释

目前，在难溶性药物相关制剂开发中，纳米载药系统是主要研究对象，其虽具有可改进药物水溶性、能进行靶向修饰、增强生物利用度等特点，但部分纳米载体可能存在生物相容性、降解性较差等问题，因而其运用仍存在一定局限性[16]。作为一种新型生物材料，短肽RADA16由天然氨基酸合成，其结构简单可控，以及可在体内生物降解且具有良好生物相容性等特点，以其为载体的药物递送系统的研究逐渐增多[17]。目前，在已设计出的各种类型的纳米自组装短肽中，运用于药物传递载体的短肽，研究最多的是离子互补型自组装短肽中的RADA16、EAK16及其衍生短肽[18]。

RADA16包含一个亲水面和疏水面，在分子力作用下，其疏水表面可与难溶药物的疏水区域相互作用形成短肽—药物复合物，增强药物在水溶液中稳定性的同时，使得难溶药物能以自组装短肽为媒介进行包载和缓释；此外，RADA16在生理条件下形成的短肽水凝胶具有一定黏弹性，这对药物起到一定缓释作用[18]。目前，在自组装短肽作为难溶药物载药系统的相关报道中，以研究模型水难溶性药物芘和抗肿瘤相关药物的报道居多。Tang等[19]发现化合物芘与RADA16相互作用时可形成胶态悬浮液，药物以微晶形式包载于短肽自组装形成的非极性的微环境中，初步证明RADA16与水难溶药物之间存在疏水相互作用。在抗肿瘤药物缓释载体的应用当中，唐富山等[20]初步证实RADA16自组装短肽具有作为抗肿瘤药物原位水凝胶载体并运用于体内的潜力，并将其应用于芒果苷原位水凝胶抗肿瘤细胞增殖作用中[21]。此外，该团队在RADA16基础上设计出具有不同疏水侧链的新型自组装肽RVDV16，研究结果表明RADA16与RVDV16均可与大黄素形成相对稳定的悬浮液，在生理条件下形成原位水凝胶，而大黄素通过该原位水凝胶维持甚至增强对肿瘤细胞的增殖抑制作用[22]。除此之外，将抗肿瘤药物附着在RADA16短肽结构上还可能发挥许多释药优点，如改良药代动力学，或者通过靶向作用改善药物的生物分布等[23]。

除了难溶性药物，对于水溶性药物来说，自组装短肽RADA16也是一种良好的释药载体。RADA16曾广泛运用于水溶性蛋白类药物(如溶菌酶[24]、功能性蛋白质血管内皮生长因子[25]、转化生长因子-β1[26])和非蛋白类水溶性药物(如奎宁、吲哚洛尔[27])等的释放。与疏水药物的载药机制不同，水溶性药物是在短肽带电氨基酸的电荷作用下连接于肽侧链上并缓慢释放。既往研究表明两亲性聚合物通常更有利于多肽和(或)蛋白的稳定[28]，因此具有两亲性的自组装短肽RADA16在包载和释放药物的过程中不会对蛋白质本身的结构造成改变，并且在一定程度上还利于蛋白质活性的保持。但值得注意的是，由于RADA16带电氨基酸的电荷性，当作为蛋白质药物的递送载体时，其释药速率可能与蛋白质表面所带的电荷有关。此外，通过调整RADA16浓度亦会改变其水凝胶的流变学特性和药物释放速率等[18]。

综合来看，影响纳米自组装短肽RADA16发挥释药效应的因素除了其自身形成的纳米纤维网格结构、两亲性特点及带电荷性质外，还与药物本身的理化特性等相关。作为一种新型生物材料，虽然目前对自组装短肽RADA16的载药研究仍停留在体外研究，但有理由相信该材料在载药领域的发展前景是巨大的。

3 再生医学/组织修复

在组织工程中，通常认为细胞、支架和信号生物分子是组织工程的三个主要组成要素。支架起着承载介导细胞反应和信号生物分子的关键作用，选择合适的支架，可为再生细胞的生存、增殖和分化提供更为有利的3D微环境。纳米自组装短肽RADA16具有良好生物相容性、降解产物可控及无免疫原性等特点，易通过固相方法合成且易修饰，不仅可以作为多种细胞的3D生长支架，同时还可作为修复损伤和维持机体组织功能的生物替代物，是组织工程中运用较为广泛的一种新型生物材料，目前多应用于神经组织、骨组织、皮肤组织等领域的再生研究[29]。

3.1 神经组织修复

神经损伤易造成神经功能缺损，随着医学发展，生物工程技术为神经损伤的修复提供了新的途径。早年吕斐等[30]通过构建脊髓损伤动物模型，发现RADA16短肽溶液对急性脊髓创伤组织具有一定的保护作用；将其应用于大鼠横断喉返神经损伤的再生修复亦是有效的[31]。短肽RADA16可为包括神经细胞在内的多种干细胞提供适宜生长和分化的3D微环境，近年来多项研究表明，通过结合各种功能肽序列基序，可以制备性能更加优越的纳米自组装肽纤维支架。来自天然蛋白质的附加功能基序具有多种生物活性，如促进细胞黏附[32]，促进神经突起生长[33]，促进成骨细胞增殖、分化和迁移[34]等。将功能序列RGD和IKVAV设计修饰在RADA16短肽结构上形成RADA16混合短肽并用于大鼠颅内出血修复当中，发现RADA16混合短肽水凝胶在促进神经纤维生长的同时，还可减少细胞凋亡、抑制胶质细胞高表达并降低免疫反应[35]。在SD大鼠坐骨神经缺损、脑出血、脊髓横断3种模型中，RADA16-IKVAV/-RGD可显著修复神经损伤[36]。近来，有研究者将RADA16水凝胶与修饰了血管内皮生长因子和脑源性神经营养因子模拟肽序列的功能肽RADA16水凝胶混合后用于周围神经重建，相关实验表明，该混合水凝胶支架与单独表达血管内皮生长因子或脑源性神经营养因子模拟肽表位的支架相比，能更有效促进雪旺细胞的前髓化，以及内皮细胞的黏附和增殖[37]。将RADA16-SVVYGLR水凝胶用于斑马鱼脑损伤动物模型研究中，发现该水凝胶支架能够支持神经干细胞的生长增殖，除了促进新生血管和发育神经生成外，还增强斑马鱼视顶盖功能区域的恢复[38]。

3.2皮肤组织修复

在皮肤组织的修复中，ECM与炎症因子、细胞因子、生长因子等协同合作完成创伤修复的过程[39]。其中ECM能够连接和支撑细胞，维持细胞的生物学行为，同时保护修复细胞，促进受损表面形成胶原层，以及促进伤口收缩，并修补破损的结构组织等[40]。与传统聚合物修复材料相比，纳米自组装肽的结构具有仿生性质，更类似于天然ECM环境，利于功能型细胞在受损部位进行增殖、迁移、分化等，有助于伤口缝隙组织的再生。孟辉等[41]利用RADA16纳米短肽纤维为修复材料进行皮肤烧伤动物模型的创面修复，结果显示RADA16治疗组中，烧伤创面及伤口周围的毛发生长和早期分化表皮干细胞标志物角蛋白19的表达均优于壳聚糖修复组、胶原修复组及空白对照组，其修复机制可能是RADA16水凝胶为创面修复提供了模拟体内ECM的微环境，并且其高含水量特性可以使得创面保持一定湿润，有利于各种腺体及细胞的再生和修复，同时也利于修复后期的胶原蛋白重新排列。Bradshaw等[42]将功能肽FPG(序列FPGERGVEGPGP)连接于RADA16短肽末端并应用于皮肤创面修复，通过检测角化细胞和真皮成纤维细胞的增殖情况和迁徙情况，发现该短肽材料可加强细胞迁徙，并能够明显促进伤口愈合。亦有研究以RADA16水凝胶作为载体，应用于小鼠皮肤源性前体细胞再生并取得成功[43]。此外，有研究者将RADA16水凝胶支架与其自主开发的3D弹性支架PLCL结合用于皮肤缺损修复研究当中，发现在RADA16末端修饰添加了P物质(一种存在于脊椎动物神经系统中的氨基酸神经肽)的实验组，其血管生成能力、间充质干细胞募集能力等都优于RADA16未修饰组，故认为该组合支架可用作真皮再生过程中的替代物[44]。

3.3 骨组织修复

理想的骨组织修复材料除了应具备生物相容性良好的特点外，其产物还应可降解，同时具有良好的骨传导性和骨诱导性。传统骨修复的材料如聚合物、金属材料、生物玻璃和生物陶瓷等，因其低成骨活性、低生物相容性和低降解速率等缺点，无法形成具有生物功能的骨组织，难以从根本上实现修复缺损的功能[45]。研究者将RADA16短肽水凝胶应用于SD大鼠头顶骨损伤模型研究，通过X光检测发现有新骨生成填充，证明RADA16能有效修复骨损伤[46]。在SD大鼠股骨髁缺损修复中，RADA16短肽水凝胶能促进缺损部位生成更为成熟的新生骨组织，同时还显示出一定的储存和释放碱性成纤维细胞生长因子的潜力，促进骨愈合[47]。在对自组装短肽RADA16的C末端进行修饰后，可有效提高成骨前体细胞黏附、增殖以及成骨分化能力[48]。在RADA16的 C端添加KPSS生物活性基序(序列GGKPSSAPTQLN)后，既可促进骨髓间充质干细胞增殖、分化和趋化迁移，在体外培养的椎间盘模型中，还可在移植后很长一段时间内保持活力，发挥一定的椎间盘缺损修复效果[49]。值得注意的是，虽然RADA16在骨组织工程中发挥出了良好的修复潜力，但由于RADA16水凝胶的机械力相对较弱，在面对较大的骨缺损或负重骨缺损时，还不能提供足够的机械支撑。因此，若能将RADA16支架材料与其他具有良好机械强度的材料相结合，在骨组织修复应用上将可能取得更好的治疗效果。

3.4 其他组织修复

除以上组织工程修复的应用外，早期亦有纳米自组装短肽RADA16成功用于角膜组织损伤的修复的报道[50]。Takeuchi等[51]用2.5%RADA16短肽水凝胶填充大鼠第一磨牙缺损部位，发现RADA16明显促进牙周缺损愈合。此外，RADA16及其衍生物亦可用于牙周韧带组织再生[52]、血管生成[53]等的修复。

4 其他方面应用

纳米自组装短肽RADA16-Ⅰ最早由美国麻省理工学院和香港大学的Ellis-Behnke小组发现可用作止血剂[54]。Song等[55]研究发现，2%RADA16水凝胶在大鼠肾切除模型中的止血效应与天然高分子材料吸收性明胶海绵一致，但短肽水凝胶在发挥止血效果的同时，更能减少材料所带来的组织炎症反应。需要注意的是，生物材料在发挥止血功能的同时，其血液相容性是否良好亦十分重要。Taghavi等[56]研究分析了不同浓度(0.1%，0.2%，0.3%和0.5%)条件下RADA16的血液相容性，结果表明该材料与血液接触时血液的组成没有发生变化。在临床前期的动物实验中，RADA16水凝胶在兔腹主动脉穿刺出血模型中亦能发挥良好的止血效应[57]。截至目前RADA16是纳米自组装短肽止血材料中研究最深入应用最广的一种材料，其商业产品PuraMatrix也逐渐应用于科研实验和临床前期研究。随着探索深入，研究者们设计挑选出不同的功能肽基序与RADA16短肽结合，研发出了止血效应更优良的衍生材料，如RADA16-GRGDS和RADA16-YIGSR，二者能够在大鼠肝脏打孔出血模型中发挥更优异的止血效果[58]。此外，也有研究报道利用基因重组技术将类弹性多肽ELP融合到RADA16氨基酸序列上，可形成具有优于胶原材料止血效应的RADA16功能肽[59]。

除了止血，纳米自组装短肽RADA16亦可应用于抗菌肽的相关研究当中。抗菌肽是大多数生物体内产生的抵抗病原体的小分子肽类活性物质，是机体内天然免疫防御屏障的重要组成部分[60]。目前已分离鉴定出两千多种抗菌肽，以动植物、细菌来源的天然抗菌肽为主要来源。天然抗菌肽一般由10～60个氨基酸残基组成，具有两大特征结构：带正电荷的氨基酸残基和疏水氨基酸残基[61]。天然抗菌肽存在产量较低、生产成本高等问题，故研究者们通过设计抗菌肽片段、改变氨基酸序列等途径来不断探索产量更高、甚至具有更高抗菌活性的人工抗菌肽。早年有将纳米自组装短肽材料用于抗菌肽设计与研究的代表性报道[62-63]。虽然纳米自组装抗菌肽的抑菌机制目前尚未完全阐明，但可以了解到的是自组装短肽结构中的正电性和疏水成分在其抗菌作用中起重要作用：细菌具有聚阴离子表面，而纳米自组装抗菌肽的结构特点使其能与细菌细胞膜表面负电荷产生静电作用，从而稳定吸附于细菌细胞膜上，随后其疏水链段与脂质膜疏水相互作用，细胞膜通透性增加，胞膜裂解，抗菌肽进入细胞内作用于胞内酶、蛋白质、DNA 等物质，达到抑制细菌生长的作用[64-65]。而近年来，对离子互补型自组装短肽抑菌活性的探索研究亦有不断新发现。李会林等[66]探究不同浓度RADA16对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、大肠埃希菌三种常见菌株的抑菌效果，发现0.25% RADA16短肽水凝胶短时间内即能发挥良好的抑菌活性。将RADA16短肽水凝胶与具有良好抑菌能力的阳离子抗菌肽结合，用于体外抑菌实验探索，发现RADA16水凝胶形成的稳定结构为抗菌肽的持续释放作用提供了重要载体平台，不仅可以抑制金黄色葡萄球菌繁殖，还可一定程度促进骨髓间充质干细胞增殖，增强其成骨能力[67]。

若能进一步深入结合自组装短肽具有的独特自组装特性、化学修饰广泛可能性等特点，纳米自组装抗菌肽材料的研究将有可能为解决抗生素、抗菌剂等持续使用产生的耐药性问题开辟新的解决途径。

5 小结与展望

作为一种人工合成的新型纳米生物材料，自组装短肽RADA16成分纯净、性能稳定、无免疫原性且降解产物无毒、具有较好的生物相容性，是理想的细胞培养支架材料。RADA16拥有与ECM相似的3D微结构，不仅可为细胞提供适宜生长的立体微环境，也能促进受损组织和器官修复与重建。作为一种可装载水难溶性药物、水溶性药物的智能载体，其在药物和(或)蛋白缓释运用上也具有一定的潜力。不难发现，纳米自组装短肽RADA16之所以能够发挥优越性能，与其本身的自组装特性、理化性质及形成的具有仿生性质的3D空间结构相关。