中性粒细胞胞外诱捕网在疾病中的作用

沈文祥，蒋 威，马晓宇，杨 洁，武小虎，吕亚楠，王胜义，丁学智，严作廷*

（1.中国农业科学院 兰州畜牧与兽药研究所，兰州 730050；2.内蒙古农业大学 兽医学院，呼和浩特 010018）

中性粒细胞是动物外周血中最丰富的先天免疫效应细胞，在血液循环系统中发挥免疫监视的作用。当机体受到外来入侵时，中性粒细胞迅速募集至感染部位。首先，吞噬内化病原微生物至胞内的吞噬体中，同时胞内的颗粒抗菌蛋白被传递到吞噬体中杀伤病原；其次，胞内具有杀菌作用的颗粒蛋白释放到胞外中和病原微生物；当病原太大无法被吞噬或通过进入细胞质逃避吞噬作用时，中性粒细胞会启动第三种模式——即中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NET）杀伤病原［1－2］。此外B.G.Yipp等［3］认为，细菌在被PMN吞噬后可能将未被完全杀伤的细菌释放到胞外，NET还可以防止这些未被完全杀死细菌的扩散。NET是一种细胞外的网状结构，以DNA为骨架，其上附有组蛋白、颗粒蛋白和细胞质蛋白。当刺激物不同时产生的抗菌蛋白种类数量不同，如佛波酯（phorbol 12－myristate 13－acetate，PMA）刺激中性粒细胞产生的NET包含24种蛋白，不同的铜绿假单胞菌黏液和非黏液菌株可诱导形成包含33种不同蛋白和多达50种不同蛋白的NET［4］。主要抗菌效应蛋白是来自细胞核的蛋白（组蛋白、HMGB1）和颗粒蛋白酶［如弹性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）、钙网蛋白－G和蛋白酶－3］，以及髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）等。这些蛋白具有强大的杀伤病原微生物的作用。研究发现NET上的NE会特异性切割福氏志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌的毒力因子［5－6］。NET包含的组织蛋白酶G和蛋白酶3与NE密切相关，并可能裂解不同种类病原体的毒力因子［7］。但是，NET不仅可以杀伤病原微生物，同时对感染组织周边的健康组织发起攻击，如果调节异常，NET可能会导致免疫相关疾病的发生。Chen L.等［8］研究发现，NET在败血症中可增强炎症反应，诱导正常的细胞发生焦亡。此外，最近F.P.Veras等［9］报道，SARSCoV－2可以触发PMN释放NET，引起肺上皮细胞死亡，暗示靶向抑制NET释放可能是治疗新冠肺炎的潜在靶点。

1 中性粒细胞在免疫系统中的作用

中性粒细胞也称多形核中性粒细胞（polymorphonuclear neutrophil，PMN）或粒细胞，是动物机体中最丰富的白细胞。粒细胞和／或粒细胞前体通常占骨髓和血流中有核细胞的60%［10］。成熟的中性粒细胞在血液中的典型循环半衰期为6～8 h，在组织中迁移2～3 d。它们的寿命相对较短，主要用于监视入侵的微生物。在感染期间，嗜中性粒细胞的寿命延长，粒细胞增多，并且大量嗜中性粒细胞迅速募集到感染部位。在微生物被识别和吞噬之后，中性粒细胞利用一组特殊的氧依赖和氧不依赖的杀菌剂武器来摧毁感染因子［2］。氧依赖机制包括活性氧（ROS）的产生，而氧不依赖机制包括裂解酶和杀菌肽的脱粒和释放［6］。此外，中性粒细胞还可以产生NET固定杀灭中性粒细胞不能吞噬或可以逃避脱粒释放的杀菌肽的病原。由于这些过程在杀死大多数摄入的微生物方面非常有效，中性粒细胞承担了抵御感染的主要细胞防御任务。

2 中性粒细胞胞外诱捕网形成

2.1 NET形成的机制

目前已经描述了两种NET形成机制，即通过缓慢的（120～240 min）裂解细胞死亡机制和从活细胞中快速（5～60 min）释放NET［11］。第一种是称为自杀性NET形成（suicidal NETosis）的细胞死亡途径，它始于细胞核的去分叶化和核膜的解体，持续到细胞极化丧失、染色质解聚和质膜破裂［12］。第二种是有活力的NET形成（vital NETosis），它可以独立于细胞死亡发生，包括核染色质的分泌排出，同时通过脱粒释放颗粒蛋白［13］。这些成分在细胞外组装，留下有活性的无核细胞体，可继续吞噬微生物［3］。

两种NET的形成都需要两个主要过程：（1）中性粒细胞染色质的解聚；（2）核膜和质膜通透性增加。染色质解聚主要由肽基精氨酸酶4（peptidyl arginine deiminase 4，PAD4）所催化，该酶催化组蛋白精氨酸转化为瓜氨酸，从而降低了组蛋白的强正电荷，削弱了组蛋白与DNA的结合。这种减弱的相互作用随后解开了核小体的包裹［5，14］。此外，导致染色质解聚的还有NE，NE在MPO刺激下迁移到细胞核酶解组蛋白破坏染色质紧密结构，从而促进核的解聚［15］。研究发现，在未干扰瓜氨酸化过程的情况下，使用NE抑制剂可以有效阻止真菌性肺炎中动物体内NET形成［16］。

在NET形成过程中质膜通透性增加是程序性发生的，并不是由染色质解聚后膨胀所造成的物理性破坏的结果。目前研究发现，核膜和质膜通透性增加是GSDMD成孔蛋白p30（gasdermin D p30，GSDMD－P30）在膜上打孔得以实现［13］。GSDMD以未激活状态存在于细胞内，经酶（NE、caspase）剪切后分为N端和C端结构，目前发现N端具有生物活性，GSDMD－P30是GSDMD中的一种，是打孔蛋白，可以在细胞膜上打孔增加膜的通透性［13］。

2.2 NET形成的信号通路

目前对NET形成过程通路尚不完全清楚。NET形成是一个循序渐进的过程，有几个连续的步骤：活性氧生成；NE和MPO从颗粒向核的转移；组蛋白瓜氨酸化；最后，细胞质膜的破坏和染色质的释放［17］。

最有效且最常用的NET形成（NETosis）激活剂是PKC的直接激活物——PMA。已证明PMA对NETosis通过激活Raf／MEK／ERK信号通路后，诱导NADPH氧化酶组装成功能复合物，随后产生抗凋亡蛋白和活性氧（ROS）参与NETosis［18－19］。ROS通过激活MPO，活化的MPO促进NE从颗粒中转移到细胞核内并酶解组蛋白，破坏染色体紧密包裹的结构［6］。随后MPO入核，合成次氯酸，加剧染色体解聚，从而促进NET的释放［20］。此外，ROS还可以通过激活肽基精氨酸酶4（PAD4），瓜氨酸化组蛋白，减少DNA与组蛋白之间的结合，从而促进染色质的解聚。

染色质解聚之后，质膜的破裂或成孔作用会引起NET形成。消皮素（GSDMD）最近被确定在自杀性和有活性的NETosis中发挥膜成孔的作用，GSDMD通常存在于静息细胞的胞浆中［13］。当被特定的蛋白酶切割时，会产生成孔片段——GSDMD－P30。在PMA诱导的自杀性NETosis期间，NE裂解GSDMD在中性粒细胞质膜和颗粒膜上产生GSDMD－P30孔，导致在NETosis期间膜的破裂。GSDMD孔在NETosis期间穿透核膜，有助于NETosis过程中核的通透性增加［13］。G.Sollberger等［13］报道，GSDMD抑制剂在不影响NADPH氧化酶、NE或MPO功能的情况下阻断了PMA诱导的NET代谢，强调了这一途径中对膜通透性的作用。

3 中性粒细胞胞外诱捕网与疾病

3.1 NET在新型冠状病毒感染中的作用

2019冠状病毒病（COVID－19）感染的全谱范围从无症状到急性呼吸窘迫综合征（ARDS），以过度炎症和血栓性微血管病为特征［21］。F.P.Veras等［9］研究发现，在重症COVID－19患者血液和肺部组织中均发现NET浓度增加；新型冠状病毒（SARS－CoV－2）可以直接诱导健康中性粒细胞释放NET。通过SARS－CoV－2的复制、血管紧张素的释放和丝氨酸蛋白酶的激活触发NETosis过程。SARS－CoV－2激活中性粒细胞释放的NET在体外促进肺上皮细胞死亡［22］。M.Saffarzadeh等［23］研究发现，诱导肺上皮细胞和内皮细胞死亡的成分主要是组蛋白。NET引起的血栓栓塞是引起新冠病人死亡的主要原因之一。ZUO Y.等［24］报道了NET在COVID－19时引起血栓形成导致的动／静脉血栓阻塞，由此导致的抗磷脂综合征可能危及患者生命。NET可以作为血液标志物判断新冠病人的预后。H.NG等［22］对106例中度至重度新冠病人进行为期4个月的随访研究发现，新冠病人血液中NET组成的三个主要标志物NE、cf－DNA（cell free－DNA）和citH3均显著高于健康对照组，需要辅助呼吸和短期死亡的病人NET标志物水平高于病情恢复较好的病人，该研究暗示可将NET作为判断COVID－19预后的指标。

3.2 NET与癌症

世界卫生组织对于判定是否为良性肿瘤的主要指标是，癌细胞是否能够发生转移、扩散到其他组织。最近的研究发现NET可能与癌细胞的转移有关。T.H.Snoderly等［25］发现，在乳腺癌中NETosis与增加的疾病进展、癌细胞的转移有关，NET靶向疗法已在临床前癌症模型中显示成功，并可能证明在减缓或中止乳腺癌患者的肿瘤进展方面具有重要的临床目标。YANG L.等［26］研究发现，癌细胞上的跨膜蛋白CCDC25可以作为NETDNA复合物受体感知胞外DNA并激活ILK－βparvin（integrin－linked kinase－β－parvin）通路，增强癌细胞的运动性。

3.3 NET与自身免疫病

自身免疫病包括类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、抗中性粒细胞胞浆抗体（anti－neutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA）相关性血管炎、牛皮癣和痛风等［27］。研究表明，在形成NETs的过程中，NETosis和NET降解之间的失衡可能与自身免疫性疾病有关［28］。白细胞介素－8、ANCA和其他炎症分子被认为在NET形成中起关键作用。长期暴露在与NET相关的caspase中与自身免疫有关，并增加了全身器官损伤的机会［29］。

3.4 NET与炎症和组织损伤

目前的研究表明，NET具有免疫保护作用，但是同时NET也可引起炎症和组织损伤。主要原因是NET的组成成分大部分为损伤相关分子模式（DAMPs）。DAMPs主要是来自于自体细胞损伤释放的物质，它们通过模式识别受体（PRR）激活免疫系统［30］。NET从PMN释放到胞外后，NET的组成成分，如来自于细胞核的高迁移率蛋白1（HMGB1）、组蛋白、DNA和来自颗粒中的β－防御素、中性粒细胞弹性酶、组织蛋白酶G（cathepsin－G）等，作为DAMPs可以引起组织损伤和炎症［31－33］。那么这些成分是怎样引起组织炎症和损伤的呢？研究发现NET可以直接杀伤上皮细胞和内皮细胞，在感染新冠时过度的NETosis导致严重的肺上皮细胞的损伤［34］。在败血症和急性损伤过程中，发现游离的组蛋白具有损伤细胞膜完整性的能力［35］。其他的NET相关蛋白如防御素可以渗透真核细胞，NE可以破坏细胞间的紧密连接［36］。

3.5 NET调节的分子机制

微生物和内源性刺激（例如与损伤相关的分子模式和免疫复合物）可触发称为NETosis的嗜中性粒细胞胞外诱捕网的形成。细菌、真菌、病毒、免疫复合物和晶体对许多受体的连接通过各种下游效应蛋白激活NETosis［37］。活化的血小板还可以通过高糖基化终产物（RAGE）和P－选择素－P－选择素糖蛋白配体1（PSGL1）相互作用的HMGB1受体触发NETosis［38］。通过MEK细胞外信号调节激酶（ERK）信号传导诱导活性氧，触发MPO途径［19］。在该途径中，NE需要MPO介导的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）的氧化活化来降解细胞质中的肌动蛋白细胞骨架，以阻断吞噬作用［20］。然后，NE转移到细胞核，通过处理组蛋白来驱动染色质的解聚。MPO和原癌基因DEK的结合以及PAD4的激活也促进了染色质的解聚，这使组蛋白瓜氨酸化［39］。自噬也被认为在NET的形成中起作用。吞噬受体通过促进吞噬小体的形成抑制NETosis，从而响应小型微生物，吞噬小体的形成使NE远离核［40］。唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素（Siglec 5和Siglec 9）通过限制中性粒细胞活化和ROS生成来抑制NETosis［41］。内源性丝氨酸蛋白酶抑制剂可以通过抑制NE 来阻断NETosis。

4 展望

NET在宿主免疫防御中发挥重要作用，同时过度释放的诱捕网会引发各种疾病，因此靶向诱捕网治疗疾病可以作为新的研究方向。NET还可作为标志物判断某些疾病的严重程度。在NET被发现的早期，其捕获微生物的能力引起了研究者们极大的热情，但最近其致病潜力吸引了人们的关注。NET是有益还是有害与调节其形成的方式和产生水平有关，如组成性激活、抑制机制失调和NET产量过高可能是导致疾病的重要致病机制。因此认为剂量、NET释放和清除的时间调节是NET能否致病的关键因素。在自身免疫中，异常的NETosis可能是由于先天的耐受性被破坏导致的，但NET在炎症性疾病的发病机制中似乎发挥了主要作用。NET增强或抑制炎症的能力在无菌疾病和其他未知情况下可能具有有益的作用。考虑到大量的NET蛋白，可能会发现新的NET功能。更好地了解NET的功能和对动物健康的影响将能够抑制有害属性，而不会干扰有益属性，并最终使我们能够利用NET来治疗疾病。