口腔鳞状细胞癌中RAI14的表达及其临床意义

张超杰，仵楠，赵举红，齐元莉，祖木热提古丽·阿不来提，李朝阳，徐江*

(1 石河子大学医学院,新疆 石河子 832000；2 石河子大学医学院第一附属医院,新疆 石河子 832000； 3 广州医科大学附属肿瘤医院，广东 广州 510089)

口腔鳞状细胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma,OSCC)是颌面部发病率最高的恶性肿瘤，全球发病率达到40万/年，死亡率达18万/年[1]，近年对OSCC发病病因、预后治疗等方面的研究取得进展，但患者的5年生存率未明显改善[2]。因此如何提高OSCC的5年生存率，寻找有效预测OSCC患者预后的因子，识别新的分子靶点至关重要。

维甲酸诱导蛋白14(retinoic acid induced protein 14，RAI14)是2000年被Peng YF等[3]研究抗tomosyn抗体时在大鼠肝脏发现的RAI14基因编码的第一个转录产物，是由6个锚蛋白重复序列和长卷曲螺旋域组成，RAI14蛋白通过此结构域招募多种信号及蛋白进而调控细胞骨架[4-5]。RAI14在人体许多组织中都有表达，参与多种生理和病理过程，如在人胎盘和睾丸组织此蛋白高表达且与细胞骨架密切相关[6-7]。而在卵巢癌[8]、前列腺癌[9]、胃癌[10]等肿瘤中RAI14的高表达与肿瘤的恶性进展呈正相关,且与癌细胞的增殖侵袭密切相关[11]。目前国内外研究中关于RAI14在OSCC中的表达水平和临床意义的报道较少，本研究利用免疫组织化学检测分析RAI14在OSCC、癌旁和正常口腔黏膜组织表达水平，并探究RAI14与OSCC患者临床病理特征及预后的关系，进一步探讨RAI14在OSCC发生、发展及转移中的作用。

1 材料与方法

1.1 标本及数据来源

收集2009年—2020年在石河子大学医学院第一附属医院经组织病理确诊为OSCC石蜡组织标本152例、癌旁组织90例和正常口腔黏膜组织25例。收集OSCC患者的详细临床信息并进行统计学分析，其中，男性82例，女性70例。患者年龄范围32～85岁，中位年龄68岁。病例的TNM分期以第八版国际癌症控制联盟标准(AJCC)为依据。

1.2 免疫组化检测及结果判读

按规范操作进行免疫组织化学染色，采用EnVision两步法检测RAI14在OSCC、癌旁及正常口腔黏膜组织中的的表达情况，RAI14兔单克隆抗体(ab137118工作浓度为1∶100，英国Abcam)。免疫组织化学染色结果由2名病理医师采用双盲方法进行评价。根据染色强度[4](无着色=0，弱=1，中等=2，高=3)和染色细胞百分率(<1%=0，1%～10%=1，11%～50%=2，51%～80%=3，81%～100%=4)进行免疫组织化学评分,每个组织免疫反应分数(IRS),由染色强度×阳性细胞百分率得出。IRS<4分低表达组，IRS≥4分高表达组。

1.3 统计学分析

采用SPSS21.0软件对实验数据进行分析。采用卡方检验分析RAI14在OSCC、癌旁及正常口腔黏膜组织中RAI14表达水平差异及与临床病理因素的关系。Kaplan-Meier进行生存分析并绘制存活曲线。通过COX比例风险模型进行单因素及多因素分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RAI14在OSCC中的表达情况及与临床病理因素的关系

免疫组织化学方法检测结果显示RAI14主要分布在细胞的细胞质及细胞膜上(图1)，RAI14在OSCC、癌旁及正常口腔黏膜组织中的高表达率分别为59.2%(90/152)、31.44%(31/90)和16.00%(4/21)，差异有统计学意义χ2=22.446，P<0.001(表1)。

图1 OSCC、癌旁及正常口腔黏膜组织中RAI14的表达情况

表1 OSCC、癌旁及正常口腔黏膜组织中RAI14的表达

RAI14的表达与肿瘤的分化程度、TNM分期均相关，P<0.05(表2)，与年龄、性别、T分期、淋巴结转移等无明显相关性，P>0.05(表2)。

2.2 OSCC中RAI14表达水平与预后

152例OSCC患者中，90例有完整的随访信息，随访截至2020年7月30日，随访时间为(2～136月)，中位随访时间为35个月。利用Kaplan-Meier对90例有完整随访信息的免疫组织化学染色结果进行分析并绘制生存曲线，结果表明RAI14高表达患者的生存时间(2月～125月，中位时间为31月)明显少于RAI14低表达患者(5月～136月，中位时间为41月)，两组差异有明显的统计学意义,χ2=6.748，P=0.009(图3)。

图2 RAI14表达与OSCC患者预后的生存分析

COX单因素分析结果表明，肿瘤的分化程度(P=0.029，HR为0.504)、TNM分期(P=0.034，HR为0.525)、RAI14表达量(P=0.013，HR为0.446)是影响OSCC患者生存时间的重要因素。COX多因素生存分析显示RAI14高表达(P=0.034，HR为1.996)与OSCC患者死亡有关，是OSCC患者预后不良的独立预测因素(表3)。

表3 COX单因素及多因素分析

3 讨论

RAI14可通过全反式维甲酸在人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)中诱导产生[3]。越来越多的研究表明，RAI14在某些恶性肿瘤的化疗药物反应和癌细胞增殖和侵袭过程中起关键作用。如HSU等[12]通过癌基因侵袭能力及抗药能力的全基因组分析，发现RAI14与EGFR、ITGA3、MYLK、AHNAK、GLS、IL32和NNMT等8个基因，与紫杉醇，多西他赛，厄洛替尼，维罗莫司和达沙替尼等肿瘤化疗药物显著相关。SHEN等[13]表明RAI14通过mTOR信号增强NF-kB活化及相关炎症效应，已经证实NF-kB信号传导途径涉及肿瘤及神经退行性疾病等多种病理状况，表明RAI14与肿瘤的发生密切相关。进一步研究中，CHEN等[14]通过敲除RAI14基因下调Akt通路，来抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡；同时，其下游蛋白Cyclin D1在RAI14缺陷细胞中的表达也降低；HAWKINS等[8]在卵巢癌中研究表明NR2F2通过调节NEK2、RAI14从而影响其他多种相关基因的表达来影响卵巢癌的细胞周期，RAI14基因表达可能会影响卵巢癌细胞的增殖和凋亡；PAEZ等[9]在前列腺癌中发现RAI14参与肿瘤细胞骨架细胞间的调节,可以影响细胞的侵袭、迁移及细胞的粘附性；WANG[15]研究表明，RAI14的低表达可以抑制STAT3激活和下游因子的表达来抑制癌细胞的增殖，侵袭和迁移；但YUAN[16]等分析肺腺癌发现RAI14在A549和71例患者中的31例上调，其高表达可抑制细胞增殖，表明RAI14有作为肺腺癌新的生物标记物的潜力。以上观点表明，RAI14的表达各种与肿瘤的发生发展密切相关，但关于RAI14在OSCC中的表达相关研究报道较少，本研究采用免疫组织化学方法检测RAI14蛋白的表达水平，在OSCC、癌旁及正常口腔黏膜组织中RAI14的高表达分别为59.2%(90/152)、31.44%(31/90)和16%(4/25)，差异显著，结果提示RAI14可能是促进OSCC发生发展的癌基因。

本研究采用卡方检验分析发现OSCC中的RAI14的高表达与肿瘤的分化程度(P=0.021)及TNM分期(P=0.025)均相关，提示RAI14的高表达与OSCC的发生发展有一定的关系。COX单因素分析表明，RAI14表达量(P=0.013，HR为0.446)、肿瘤的分化程度(P=0.029，HR为0.504)、TNM分期(P=0.034，HR为0.525)是影响患者生存时间的重要因素，这与临床病理因素分析结果一致。Kaplan-Meier结果表明，OSCC中RAI14高表达患者的术后生存时间明显低于低表达患者(P=0.009)，说明RAI14表达与OSCC患者的生存率相关，可以用RAI14来判断OSCC患者的预后，COX多因素分析进一步证实RAI14高表达是OSCC患者预后不良的独立预测因素(P=0.034，HR=1.996)，与患者的死亡有关。这与RAI14在胃癌及乳腺癌中的过表达是预后不良的独立预测因素研究结果一致[12.15]。以上结果表明RAI14表达与OSCC患者的临床病理特征及预后密切相关，RAI14可能是参与OSCC生长和转移的关键基因之一。

综上所述，本研究发现RAI14在OSCC组织中高表达，RAI14高表达与患者的预后不良相关，可能可以作为OSCC患者预后评估的潜在生物标志物。后续进一步扩大样本量完善临床信息，结合分子生物实验进一步探索RAI14在OSCC发生发展中的具体机制。