人类辅助生殖技术用医疗器械胚胎毒性检验

【作 者】史建峰，王蕊，韩倩倩

中国食品药品检定研究院，北京市，102629

0 引言

近年来，受环境污染加剧、生活压力增加、生育年龄推迟、人流群体和育龄人群患癌年轻化等因素影响，人类生育力水平成持续衰减状态。世界卫生组织（WHO）预测不孕不育症将被列入21世纪人类三大疾病之一，仅次于肿瘤和心脑血管疾病。在我国，根据中国人口协会、国家卫生健康委员会发布的数据显示，我国育龄夫妇的不孕不育率从二十多年前的3%左右上升到近年的15%左右。目前，人类辅助生殖技术（human assisted reproductive technologies,ART）是治疗不孕症的有效手段，在近年来得到广泛应用，该技术包括体外受精-胚胎移植、卵泡浆内单精子显微注射、胚胎植入前遗传学诊断和胚泡转移技术、配子/合子/胚胎冷冻-复苏以及其他衍生技术。ART相关的医疗器械主要分为液体类产品、器具类产品和专用仪器，此类医疗器械在使用过程中不仅与人体接触，还会与生殖细胞、受精卵和胚胎接触，会影响子代的健康和发育，因此需要重视此类产品的风险管理。国家药品监督管理局陆续发布《人类体外辅助生殖技术用液注册技术审查指导原则》（2018年第18号）、辅助生殖用胚胎移植导管注册技术审查指导原则（2019年第78号）和辅助生殖用穿刺取卵针注册技术审查指导原则（2020年第31号）。人类辅助生殖技术用医疗器械的生物相容性评价除常规检验项目以外，还需要建立更具针对性的检验方法，以保证产品的安全性。其中，胚胎毒性评价是人类辅助生殖技术用医疗器械安全性评价体系中的重要组成部分，当前主要包括体外鼠胚试验和囊胚细胞染色和计数试验。

1 体外鼠胚试验

1.1 体外鼠胚试验在人类辅助生殖技术用医疗器械的安全性检验中的应用

体外鼠胚试验（mouse embryo assay,MEA）是用于评估辅助生殖实验室培养系统的重要方法[1-3]。在人类辅助生殖技术用医疗器械安全性评价和监督管理中，美国食品药品管理局（Food and Drug Administration,FDA）最先实施，并于1998年在美国联邦法规（Code of Federal Regulations,CFR）指导原则中明确了将产品MEA试验数据纳入注册资料中[4]。在我国，原国家食品药品监督管理总局于2016年发布该试验方法的行业标准YY/T 1434-2016 《人类体外辅助生殖技术用医疗器械 体外鼠胚试验》[5]，为相关器械产品的研发、生产和监管提供了技术支撑。

1.2 体外鼠胚试验根据产品临床使用进行检验

MEA是利用小鼠胚胎代替人胚胎，模拟产品的临床使用，在体外培养环境中将鼠胚与产品进行接触，通过鼠胚的囊胚发育情况来评价产品对胚胎发育的潜在毒性（见图1）。例如器具类产品主要为制备产品的浸提液与鼠胚进行接触；液体类产品中洗涤液、操作液、活检液及移植液等短期接触产品通常与鼠胚接触20 min后再转入胚胎培养液中继续培养；序贯/全程培养液则根据其在胚胎培养发育阶段的使用情况来与鼠胚进行接触。

图1 体外鼠胚试验结果观察Fig.1 Observations of MEA

1.3 试验操作对试验结果的影响

根据现行标准，MEA采用体内受精的方法，取1-细胞或2-细胞进行试验。由于1-细胞对环境的反应更加敏感[6-7]，该标准推荐使用1-细胞试验方法。MEA是一个对技术操作要求较高的试验，操作熟练程度会直接影响试验结果。胚胎在母体中处于厌氧环境，大部分哺乳动物细胞氧含量为2%～9%[8]，在脱离母体后，应尽快处理鼠胚以减少在环境中的暴露时间，这是由于环境的氧浓度较高会对胚胎形成率和发育质量造成不利影响[9-10]。另外，在处理鼠胚前，需要将长期接触鼠胚的检测样品液、操作液、培养液表面覆盖组织培养用油并在培养环境下进行预平衡（通常为4 h～18 h），使温度、pH值、氧含量和渗透压达到一个稳定状态。在鼠胚清洗和转移的操作中，熟练的技术会在达到操作目的的情况下，减少鼠胚在操作液的停留时间，使其尽快进入最佳培养环境中。同时，熟练的技术对试验稳定性和平行性也具有积极影响。

1.4 培养体系对试验结果的影响

MEA需要对雌鼠进行超数排卵以获得足够的卵细胞，超数排卵主要是通过孕马血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin,PMSG）与绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin,HCG）联用，而获得卵细胞的数量和成熟度会有所差异，进而影响受精率和胚胎质量。不同品系的小鼠经超数排卵后获得的卵子/受精卵数量也有所不同，但一次试验中在各小鼠中收获的受精卵的数量差异不宜过大，数量太少或太多均对胚胎质量有不利影响[11]。接触检测样品液之前，要挑选大小和形态正常的受精卵进行试验，避免收集空泡、白斑、周隙、胞浆颗粒、极体和透明带异常的受精卵，这会对后期囊胚形成率的结果判定造成干扰。每只小鼠收集的受精卵也应该尽量平均地分配到各个试验组中，避免个体差异影响结果判定。

2 囊胚细胞染色和计数试验

2.1 囊胚细胞计数是对MEA的重要补充

MEA以囊胚形成率作为试验结果的判定指标，然而这一判定指标不能全面反映产品的安全性能，这是由于囊胚形成率不能代表囊胚发育的质量，例如鼠胚分别在氧浓度为5%和20%的培养条件下得到的囊胚形成率相近，但是囊胚细胞数和孵化程度却有很大差异[12]。又如具有正常形态学的囊胚，其细胞数仍有可能较少且发育潜能较差[13]。因此，需要在MEA的基础上建立检验囊胚发育质量的试验方法。相较于囊胚扩张程度和孵化状态等形态学观察，对囊胚细胞计数是一种更加客观、实用的方法，这一方法通过大量研究也得到了充分验证[14-17]。因此，通过对囊胚细胞进行计数，可以在一定程度上反映囊胚的发育质量，也是对体外鼠胚试验的一种重要补充。

2.2 囊胚细胞的分系、染色和计数

早期胚胎发育包含一系列重要事件，如卵裂、致密化和囊胚形成。胚胎在8-细胞开始致密化[18]，也是胚胎发育过程中的第一次分化。致密化主要是细胞黏附分子E-cadherin（Cdh1）在细胞间接触膜中的积累所介导[19]，卵裂球间发生黏附，单个细胞膜已经不存在，进而挤压使细胞形状发生改变，致密化后的桑椹胚的内部细胞将发育成为囊胚的内细胞团（inner cell mass,ICM），而外部细胞将发育成滋养外胚层（trophectoderm,TE）。在8-细胞期由于细胞的极化作用，使基因调控水平不同，如Cdx2（caudal type homeobox 2）在胚胎外周发生极化的细胞中表达水平升高，在胚胎内部非极性细胞表达水平较低。而维持胚胎干细胞多能性的关键基因Nanog，Oct4和Sox2与Cdx2呈相反的趋势。将Cdx2作为TE的标志调节因子，而将Nanog，Oct4和Sox2作为ICM的标志因子，通过应用识别以上标志因子的荧光抗体对TE和ICM进行染色，以达到囊胚细胞分系、染色和计数的目的。另外可以用DNA荧光染料对囊胚总细胞进行染色和计数（见图2）。

图2 囊胚细胞荧光染色图像Fig.2 Fluorescent staining of blastocyte

2.3 囊胚细胞染色和计数方法的标准化

囊胚细胞染色和计数是对MEA的重要补充，建立标准化的试验方法可以为人类辅助生殖技术用医疗器械的质量评价、行业规范和监管提供技术支持。中国食品药品检定研究院作为人类辅助生殖技术用医疗器械标准化技术归口单位，组织起草了行业标准YY/T 1688-2021《人类辅助生殖技术用医疗器械 囊胚细胞染色和计数方法》，该标准通过对囊胚总细胞和内细胞团细胞进行荧光染色、计数，将总细胞和内细胞团细胞的数量作为良好囊胚的判定指标，通过良好囊胚率来评价囊胚的发育质量。目前该标准已经形成报批稿提交国家药品监督管理局医疗器械标准管理中心。

3 面临的挑战

在我国已经有两种试验方法可以用于人类辅助生殖技术用医疗器械的安全性检验，而且均进行了标准化，另外我国关于人类辅助生殖技术用医疗器械已发布了6个行业标准，我国在该类器械领域的标准化技术水平已处于领先地位。但是，上述两个方法均有一定的局限性，例如，MEA中小鼠品系对试验敏感性影响较大，目前常用F1代小鼠对培养体系并不敏感[20-21]，而且小鼠胚胎对次优环境的适应能力更强[22]，这些都是会影响MEA的灵敏性。目前MEA采用体内受精方法，而如精子洗涤液、取卵液和卵母细胞发育培养液等受精前使用的产品，现行标准的适用性受到一些限制。另一方面，与体内受精相比，体外受精虽然不会使囊胚形成率降低[23]，但是会对囊胚发育造成不利影响[24]。囊胚细胞染色和计数虽然可以在一定程度上反映囊胚的质量，但是在对囊胚发育潜能的评价中，该试验结果的提示作用有限，需要建立新的试验方法予以支持。

4 展望

体外鼠胚试验和囊胚细胞染色和计数试验已经应用于多种人类辅助生殖技术用医疗器械的安全性检验，在细胞水平上对产品的潜在毒性进行检验。未来需要优化试验系统来提高敏感性和稳定性，如选择更加敏感的小鼠品系、营养成分更加简单的培养系统使鼠胚对毒性物质反应更加灵敏。另一方面，在这两种方法的基础上，检验技术还需继续延伸，建立新的方法，如在分子水平上对调控生长和发育的关键基因的表达进行检验，来检验医疗器械产品对胚胎发育潜能的影响。