不同日龄的Rncat 小鼠晶状体组织γS-晶状体蛋白G489A突变体表达观察

商文文，陈欣如，娄秉盛，陈雪艺

1 新疆医科大学第一附属医院眼科，乌鲁木齐 830054；2 新疆维吾尔族自治区疾病预防控制中心

先天性白内障是一种晶状体透明性眼病，可导致儿童视力障碍和失明。据世界卫生组织（WHO）估计，全球有超过1400 万例儿童因双侧白内障致盲，占失明的50%以上［1］。晶状体透明性和折射率主要依靠晶状体蛋白。到目前为止，在编码晶状体的蛋白质中已发现超过266 个基因突变可导致先天性白内障［2］。以上研究多在分子层面探索导致先天性白内障发生的机制，而对具有生物学功能的突变体（蛋白）相关研究较少。Rncat 小鼠是一种自发发育和遗传特性与人类白内障很接近的近交系常染色体隐性遗传小鼠品系，此类小鼠编码γS-晶状体蛋白的Crygs基因在外显子3第489位由纯合子G突变为A［3］，导致正常γS-晶状体蛋白碳端有16个氨基酸被截断，产生了γS-晶状体蛋白G489A 突变体（以下简称γS-G489A 突变体），最终可导致小鼠双眼单纯性核性白内障。2020 年6 月—2021 年1 月，我们观察并比较γS-G489A 突变体在不同日龄小鼠晶状体组织中的表达变化，以期了解该突变体在Rncat小鼠晶状体蛋白变性中的作用。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 出生第3、20、40、60 天的Rncat 小鼠（先天性白内障模型小鼠）各4 只，出生第3、20、40、60 天没有白内障的正常昆明小鼠各4 只，雌雄不限，均无特定病原体（SPF 级），由新疆维吾尔族自治区实验动物中心提供。双氧水，DAB 免疫组织化学显色试剂盒（E670033-1000）；苏木素染色液（E607317-0100，BBI）；中性树胶封片剂（E675007-0100，BBI）；石蜡切片机（LEICA RM2125RT）；显微镜（OLYMPUS BX53）。其他试剂均为国产分析纯/符合实验要求。

1.2 不同日龄Rncat、正常昆明小鼠晶状体组织γSG489A 突变体表达观察 分别取出生第3、20、40 和60 天的Rncat 小鼠和正常昆明小鼠，脊椎脱臼处死小鼠，显微镜下完整取出小鼠晶状体及囊膜，10%中性缓冲液甲醛固定24 h，-20 ℃保存。将保存眼球组织脱水、透明、浸蜡、包埋后常规组织学切片。运用免疫组织化学PV二步法标准流程进行染色，使用免疫组化油性笔，圈出组织样本位置，滴加3%的H2O2-甲醇，室温15 min。滴加兔抗鼠多抗隆一抗（稀释倍数为1∶400）。滴加即用型HRP标记的鼠二抗，室温孵育45 min。DAB显色液湿盒显色，蒸馏水终止。苏木素复染5～10 min。1%盐酸-乙醇脱色10-15 s，蒸馏水终止，PBST（pH 7.4 左右）反蓝5～10 min。梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片，晾干后显微镜观察并拍片。观察不同日龄Rncat小鼠晶状体组织结构，观察晶状体核区是否出现棕色免疫物沉积，有沉积则表示γS-G489A突变体呈阳性表达；观察晶状体上皮细胞核是否超出赤道部，向前极、后极、深层皮质和核区迁移。并用Image J 软件对不同日龄Rncat、正常昆明小鼠晶状体组织γS-G489A 突变体阳性表达面积进行定量计算（%）；重复3次，取平均值。

1.3 统计学方法 采用GraphPad Prism 8.0.2统计软件进行数据处理，计量资料以表示，两组间比较用配对t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

出生第3 天的Rncat 小鼠晶状体皮质区可见少量突变体，呈淡棕色，核区淡染；晶状体上皮细胞在前囊膜下呈单层排列，接近赤道部时明显过度增殖，可见多层核紊乱排列；深层皮质和核区明显见到嗜碱性染色的晶状体上皮细胞核（见图1B）。出生第20 天时Rncat小鼠晶状体浅层皮质和核区染色稍加深；赤道部上皮细胞向前、后极迁移，可在深层皮质和核区观察到嗜碱性蓝染的晶状体上皮细胞核；核区有局限性棕染，纤维细胞变性短缩、粗糙紊乱（见图2B）。出生第40 天时Rncat 小鼠晶状体浅层皮质和核区深染，核区免疫反应比出生第3、20 天时明显；晶状体上皮细胞向前极迁移，深层皮质和核区仍明显可见上皮细胞核；纤维细胞变性紊乱（见图3B）。出生第60 天时Rncat 小鼠晶状体上皮细胞不易观察；核区反应最显著，呈边界清楚的深棕色，其间依稀可见上皮细胞核（见图4B）。正常小鼠出生第3、20、40、60 天时晶状体组织免疫组化染色结果基本一致，可以在晶状体皮质区检测到少量突变体，呈淡棕色；上皮细胞在前囊膜下呈单层整齐排列，向后延伸至赤道部，可在赤道部浅层皮质中观察到嗜碱性蓝染的晶状体上皮细胞核；核区几乎为背景色，无上皮细胞核分布（见图1A、2A、3A、4A）。

图1 Rncat、正常昆明小鼠晶状体组织γS-G489A突变体分布情况（×40）

3 讨论

γS-晶状体蛋白是晶状体中的可溶性结构蛋白，广泛分布于脊椎动物中，在进化上高度保守，由位于人类第3 号染色体和小鼠第16 号染色体上的Crygs基因编码，包含178 个氨基酸残基，全长702 bp，相对分子质量为20.8 kDa［4］，主要维持晶状体的折射率和透明性。到目前为止，已报道了多个Crygs突变与先天性白内障相关，包括G18V［5］、V42M［6］、D26G［7］、Y67N［8］、T67A［9］、G57W［10］、S39C［11］、F30S［12］等，不同位点的突变导致的先天性白内障的表型各不相同。

Rncat 小鼠是新疆维吾尔族自治区实验动物研究中心在1993 年发现的一种近交系自发突变常染色体隐性遗传品系小鼠，该小鼠出生半个月左右即可观察到晶状体出现混浊，出生一个月时可观察到晶状体核区完全混浊。在本研究中，我们对不同出生日龄正常昆明小鼠和Rncat 先天性白内障模型小鼠γS-晶状体蛋白G489A 突变体采用免疫组织化学染色法进行了定性检测。结果发现，出生第3 天Rncat 小鼠和正常小鼠均在晶状体皮质中检测到少量γS-G489A 突变体表达，表明此时核区还没有不溶性蛋白成分聚集，晶状体仍为透明状态；出生第20、40、60 天时对照组γS-晶状体蛋白突变体虽也有少量表达，但彼此相差甚微，无统计学差异，可将其看作非特异性表达。

γS-晶状体蛋白包含特殊的希腊键超二级基序结构，每个希腊关键基序由约40 个氨基酸残基组成，这些氨基酸残基折叠成四条连续的反平行链，两个连续的希腊关键基序围绕一个近似的二分体对称地插入，形成一个充满疏水侧链的楔形β-折叠［13］。当编码蛋白的基因发生突变时，亚基间相互作用遭到破坏，造成晶状体蛋白溶解性降低，发生不可逆性聚集。Rncat小鼠出生第20 天时突变体已迅速在核区聚集，小鼠出现双眼核性混浊，出生第60 天时不溶性突变体蛋白已几乎布满整个晶状体核区，是造成小鼠双眼不可逆核性混浊的原因。

另一方面，与正常小鼠相比，Rncat 小鼠不同日龄晶状体组织切片赤道部上皮细胞均有异常增殖现象，其核排列紊乱、呈多层堆积，并向前、后极迁移；亦可在晶状体深层皮质和核区见到嗜碱性蓝染的晶状体上皮细胞核，此为晶状体上皮细胞去核受阻。晶状体上皮细胞的增殖、分化、去核等过程受到多种生物因素调控，如泛素化、FGF 因子、Jagged-1/Notch［14］信号通路等，但确切机制仍未明了。

综上所述，随出生日龄增加，Rncat 小鼠晶状体组织γS-G489A 突变体表达增加。γS-G489A 突变体可能通过对晶状体上皮细胞的增殖、分化、去核过程及纤维细胞组织结构产生影响，参与先天性核性白内障的发生、发展。