脓毒症并发急性肾损伤患儿的血清miR-182-5p、miR-21-3p表达变化及其临床意义

郭艳梅，李君娥，孙慧，霍习敏，徐梅先，王晓冬

河北省儿童医院重症医学内科，石家庄050031

脓毒症是感染导致的的全身炎症反应综合征。全球每年有120 万例脓毒症患儿，病死率4%～50%，是导致全球儿童病死的主要原因［1］。急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是脓毒症常见且最严重的并发症之一，在重症患者中有较高的发病率与病死率。早期诊断AKI并及时对症治疗对改善脓毒症患儿的预后具有重要意义［2］。目前临床主要通过血清肾损伤分子（kidney injury molecule，KIM-1）、胱抑素C（cystatin C，Cys-C）、血肌酐（serum creatinine，Scr）的变化预测早期肾损伤，但以上指标对早期肾功能损伤的预测敏感度较低，常延误患儿的早期治疗。因此，寻找一种更加准确的早期肾功能损伤的预测指标是目前的研究热点。微小RNAs（microRNAs，miRNAs）是一类内源性非编码小RNA，调控细胞的多种生物学功能。miRNAs 在肾脏疾病的发生、发展过程中发挥重要作用［3］。miR-182-5p［4］与miR-21-3p［5］参与了AKI发生、发展，可为早期AKI的诊断提供新思路。但miR-182-5p、miR-21-3p 在脓毒症并发AKI中的诊断价值相关研究报道较少。本研究观察脓毒症患儿血清miR-182-5p、miR-21-3p的表达变化，分析血清血清miR-182-5p、miR-21-3p 表达对脓毒症并发AKI 的预测价值。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取河北省儿童医院2017 年5月－2020 年9 日收治的脓毒症患儿113 例，其中男76例，女37例；年龄2～10岁，中位6岁；体质量指数（BMI）13～17 kg/m2，中位17 kg/m2。根据是否并发AKI 分为AKI 组89 例和NAKI 组24 例。纳入标准：①符合脓毒症《儿童脓毒性休克（感染性休克）诊治专家共识（2015 版）》［6］诊断标准；②AKI 符合《KDIGO 急性肾损伤临床实践指南（2012）》［7］诊断标准；③患儿家属或监护人知情研究；④临床资料完整者；⑤近期未使用肾毒性药物、接受肾脏手术、造影剂检查者；排除标准：①自身免疫性疾病者；②慢性肝病者；③血液系统疾病者；④恶性肿瘤者；⑤长期使用免疫抑制剂、激素者；⑥肾炎、尿道梗阻等非脓毒症引起的肾脏损伤者；⑦既往肾脏疾病者。本研究经伦理委员会批准同意，纳入者家属均签署知情同意书。

1.2 脓毒症患儿血清肾功能指标、miR-182-5p及miR-21-3p检测 采集患儿入院后次日6 mL清晨空腹静脉血，3 000 r/min离心10 min，半径80 cm，分离血清，分为两份，置于-80 ℃冰箱中待检。其中1份采用ELISA 法检测血清肾功能指标肾损伤分子-1（KIM-1）、胱抑素C（Cys-C）、肌酐（Scr），试剂盒由上海百蕊生物技术有限公司提供，所有操作均严格按照使用说明书进行。另一份采用实时荧光定量法检测血清miR-182-5p、miR-21-3p，采用TRIzol 试剂盒（上海经科化学科技有限公司；规格100 mL）提取血清总RNA，TakaRa 逆转录试剂盒（上海臻诺生物科技有限公司；规格为20 μL/100 次）转录合成cDNA，加入miR-182-5p、miR-21-3p 引物序列。miR-182-5p上游引物5′-ACTACTTCGACTGAGACACG-3′，下游引物5′-GTCTGCATGCTGTCCTTG-3′；miR-21-3p 上游引物5′-ACTCCTACGACTTAGACATG-3′，下游引物5′-GACTGTATGCTGTCGTAG-3′；以U6 为内参，上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。miR-182-5p 反应条件：95 ℃10 min（1个循环）、95 ℃15 s、63 ℃60 s、72 ℃15 s（40 个循环），以U6 做内参校正，反应结束后得到各反应管Ct，以2-ΔΔCt代表血清miR-182-5p、miR-21-3p 的相对表达量。重复3次，取平均值。

1.3 资料收集及统计学方法 收集纳入两组患儿的一般资料，包括性别、年龄、感染部位、呼吸频率、24 小时尿量、体温、心率、急性生理和慢性健康评估Ⅱ（acute physiology and chronic health evaluation，APACHE Ⅱ，分值0～71分，得分越高说明病情越严重）、脓毒症相关的序贯器官衰竭评估（sepsis-related organ failure assessment，SOFA，分值0～44分，得分越高说明病情越严重）。

采用SPSS26.0统计学软件进行数据处理。计数资料以%表示，组间比较用χ2或Fisher检验；正态分布的计量资料以表示，两组间比较用t检验；偏态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，两组间比较用Mann-Whitney U检验；采用Pearson/Spearman相关性分析法分析血清miR-182-5p、miR-21-3p表达与脓毒症患儿血清KIM-1、Cys-C、Scr水平的相关性；采用多因素Logistics 回归法分析脓毒症患儿并发AKI 的影响因素；绘制受试者工作特征曲线（ROC）分析血清miR-182-5p、miR-21-3p 表达对脓毒症患儿并发AKI的预测价值，采用Hanley&McNeil法检验曲线下面积（area under curve，AUC）。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患儿血清miR-182-5p、miR-21-3p 相对表达量及肾功能指标水平比较 AKI、NAKI 组血清miR-182-5p 相对表达量分别为1.54（0.98，1.98）、0.35（0.28，0.39），P＜0.05；AKI、NAKI 组血清miR-21-3p 相对表达量分别为2.66（1.83，3.28）、0.85（0.75，1.00），P＜0.05。AKI、NAKI组血清KIM-1水平分别为23.32（18.70，26.51）、4.70（4.30，5.04）μg/L，P＜0.05；AKI、NAKI组血清Cys-C水平分别为1.83（1.49，2.47）、0.71（0.53，0.78）mg/L，P＜0.05；AKI、NAKI 组血清Scr 水平分别为440.11（391.28，498.90）、0.35（0.28，0.39），P＜0.05。

2.2 脓毒症并发AKI患儿的血清miR-182-5p、miR-21-3p表达量与血清KIM-1、Cys-C、Scr 水平的相关性 脓毒症并发AKI患儿的血清miR-182-5p表达量与血清KIM-1、Cys-C、Scr 水平均呈正相关（r分别为0.431、0.230、0.248；P 均＜0.05）；脓毒症并发AKI 患儿的血清miR-21-3p 表达量与血清KIM-1、Cys-C、Scr 水平均呈正相关（r分别为0.259、0.373、0.269；P均＜0.05）。

2.3 脓毒症患儿并发AKI 的影响因素 AKI 组男61 例、女28 例，年 龄6（5，7）岁；BMI18（16，18）kg/m2；感染部位为肺部42 例、腹部26 例、皮肤和软组织6 例、尿路2 例、颅内4 例及血源性感染9 例；心率（117.72 ± 7.14）次/分；呼吸频率28（26，30）次/分，体温38（37，39）℃，24 小时尿量1.45（1.25，1.64）mg/kg，APACHEⅡ评分（17.00 ± 4.74）分，SOFA 评分（5.64 ± 2.74）分。NAKI 组男15 例、女9例，年龄7（5，7）岁；BMI 17（16，19）kg/m2；感染部位为肺部10 例、腹部6 例、皮肤和软组织2 例、尿路1例、颅内1 例及血源性感染4 例；心率（115.33 ±5.51）次/分；呼吸频率27（24，29）次/分，体温37.5（36，38）℃，24 小时尿量1.81（1.66，2.27）mg/kg；APACHE Ⅱ评 分（12.42 ± 4.14）分，SOFA 评 分（4.29±2.10）分。AKI组24小时尿量明显低于NAKI 组，APACHEⅡ评分、SOFA 评分明显高于NAKI组（P＜0.05）。

以24 小时尿量、KIM-1、Cys-C、Scr、BUN、APACHEⅡ评分、SOFA评分、miR-182-5p、miR-21-3p为自变量，是否并发AKI为因变量（是=1，否=0），多因素Logistics 回归分析结果见表1。血清KIM-1、Cys-C、Scr、miR-182-5p、miR-21-3p 为脓毒症患儿并发AKI的独立危险因素（P均＜0.05）。

表1 脓毒症患儿并发AKI影响因素的多因素Logistics回归分析结果

2.4 血清miR-182-5p、miR-21-3p 表达量对脓毒症患儿并发AKI 的预测价值 ROC 曲线结果显示，当Youden指数为0.594 时，血清miR-182-5p 表达预测脓毒症患儿并发AKI 的AUC为0.820，敏感度为71.91%、特异度为87.50%；当Youden指数为0.549时，血清miR-21-3p表达预测脓毒症患儿并发AKI的AUC为0.831，敏感度为67.42%、特异度为87.50%。当Youden指数为0.737 时，血清miR-182-5p联合miR-21-3p 预测脓毒症患儿并发AKI 的AUC为0.922，敏感度为82.02%、特异度为91.67%。miR-182-5p+miR-21-3p 联合预测脓毒症患儿并发AKI的AUC 明显高于血清miR-182-5p、miR-21-3p单独预测（Z=3.039、2.864，P=0.002、0.004），敏感度、特异度也高于各指标单独预测。

3 讨论

KAI 是脓毒症发展过程中最常见、最严重的并发症之一，其病程进展快、病情严重、患儿病死率高，目前已成为儿童重症监护病室病死的主要原因。虽然近年来随着支持治疗、肾脏替代治疗、改善肾脏灌注、抗炎治疗等治疗手段不断提升，但脓毒症合并KAI 的死亡率仍然很高，因此寻找可早期预测脓毒症患儿并发KAI 的生物标志物尤为重要。研究［2］认为，脓毒症中的炎症反应失衡是导致KAI 的重要机制，炎症反应可引起肾小管坏死，损伤肾组织，同时炎性反应瀑布还会导致肾内分流，影响肾髓质灌注，导致肾脏局部缺血，损伤肾脏功能。miRNAs 是近年来新发现的一种内源非编码小RNA，长度仅20 bq 左右，能通过影响炎症反应和细胞缺血、缺氧、增殖、分化、代谢、凋亡等生物学过程或通路，参与调控AKI的发生、发展［8］。

miR-182 为miR-183 家族成员，高度保守，位于人染色体7q32.2，可结合RNA 诱导的基因沉默复合物，与靶mRNA完全或不完全互补配对，使mRNA降解或抑制翻译。自2003 年miR-182 被首次发现后，众多学者通过微阵列分析技术、Northern 印迹法、基因芯片、实时定量聚合酶链反应等技术测定了miR-182表达变化，发现其与多种恶性肿瘤相关［9］。miR-182-5p 由miR-182前体的5’端臂加工而来。研究［10］表明，肾细胞癌组织中发现miR-182-5p 低表达，上调miR-182-5p表达后，可通过激活蛋白激酶B/叉头蛋白O3α抑制肾细胞癌细胞增殖，提示miR-182-5p与肾脏疾病相关。WILFLINGSEDER 等［11］通过全基因组miRNA 和miRNA 分析发现，miR-182-5p 等20个miRNAs为移植后AKI的分子调节器，随着AKI期间整体基因表现变化而变化，参与了AKI 发生和组织修复过程，因此推测miR-182-5p 可能作为AKI 新型生物标志物。进一步研究［4］又通过反义寡核苷酸抑制AKI 患者肾脏中miR-182-5p 表达发现，抑制肾脏组织中miR-182-5p 的表达96 h 后患者的肾功能和形态明显改善，进一步说明miR-182-5p 参与了AKI发生和发展，可能成为AKI治疗新靶点。

miR-21-3p 由miR-21 前体的3’端臂加工而来，其基因位于人染色体17q23.1，该区域在肺癌、乳腺癌、结肠癌中常表现为扩增，大量证实上述肿瘤中miR-21-3p 呈高表达，具有抑癌基因作用［12-13］。HOU 等［12］研究显示，结直肠癌组织中miR-21-3p 表达上调，抑制miR-21-3p 表达后能通过母亲DPP 同源物4/细胞外调节蛋白激酶信号通路靶向RNA 结合蛋白抑制结肠癌细胞增殖、侵袭、迁移和诱导凋亡。ASSMANN 等［14］通过实时定量聚合酶链反应分析糖尿病肾病患者48 种miRNAs 发现，有9 个miRNAs 呈异常表达，其中miR-21-3p 在重度糖尿病肾病患者中明显上调，提示miR-21-3p 参与肾脏疾病。树突状细胞在肾缺血再灌注损伤中发挥重要作用，与AKI 发生密切相关。JIA 等［15］研究发现，肾缺血再灌注损伤小鼠肾组织中miR-21 表达缺乏，将miR-21 转移至肾脏后，肾缺血再灌注损伤小鼠肾功能明显改善，促炎细胞因子表达下调，提示miR-21能诱导未成熟树突状细胞表型和抗炎反应，在AKI中发挥保护作用。而miR-21-3p作为miR-21的一条互补miRNA，可能也参与AKI 发生。后续学者研究［16］也证实，使用马兜铃酸Ⅰ诱发大鼠AKI后，血浆中miR-21-3p 表达明显上调，与血肌氨酸、尿素氮密切相关，由此说明miR-21-3p可能作为AKI的一种潜在生物标志物。

本研究结果显示，AKI 组血清miR-182-5p、miR-21-3p 水平明显高于NAKI 组，符合上述研究报道，说明miR-182-5p、miR-21-3p 可能参与了脓毒症患儿并发AKI 过程，其表达升高可能是脓毒症并发AKI 患儿的肾细胞损伤严重，主动或被动释放miR-182-5p、miR-21-3p 入 血，导 致 血 清 中miR-182-5p、miR-21-3p 表达升高。KIM-1 是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白，正常肾组织中表达极低，肾脏损伤后KIM-1 mRNA 可大量表达，可快速反映近曲小管损伤，是临床常用AKI 预测生物标志物。血清KIM-1水平与脓毒症合并AKI 患者的预后密切相关［17］。Cys-C 是一种低分子量蛋白质，能自由通过肾小球，并被肾小管重吸收分解，Scr为人体肌肉代谢产物，由肾脏排泄，血液中Cys-C、Scr 浓度完全取决于肾小球滤过率，因此能反映肾小球滤过膜通透性情况，可用于早期脓毒症并发AKI 预测［18-19］。Spearman 相关性分析结果显示，血清miR-182-5p、miR-21-3p 表达与脓毒症并发AKI 患儿血清KIM-1、Cys-C、Scr 水平均呈正相关，为脓毒症患儿并发AKI独立危险因素，进一步说明血清miR-182-5p、miR-21-3p 表达与AKI的发生、发展有关。目前尚不明确miR-182-5p、miR-21-3p与AKI发生的机制，肾小管细胞死亡为缺血/再灌注肾损伤重要病理因素，铁死亡与肾脏缺血/再灌注损伤有关。DING等［20］研究发现miR-182-5p可能通过诱导铁死亡损伤肾脏，参与AKI 发生。miR-21-3p 则可通过蛋白激酶B/细胞周期蛋白依赖激酶2/叉头框蛋白O1 通路改变肾管状上皮细胞代谢参与AKI 发生［5］。本研究ROC 结果中，血清miR-182-5p、miR-21-3p表达预测脓毒症患儿并发AKI 的AUC 均大于真区域，敏感度、特异度分别为为71.91%、87.50% 和67.42%、87.50%，说明血清miR-182-5p、miR-21-3p 表达均对脓毒症患儿并发AKI 具有良好预测价值。进一步分析显示，miR-182-5p+miR-21-3p 联合预测脓毒症患儿并发AKI的AUC、敏感度、特异度均高于血清miR-182-5p、miR-21-3p单独预测，说明联合检测血清miR-182-5p、miR-21-3p可提升并发AKI预测价值。

综上所述，脓毒症并发AKI患儿血清miR-182-5p、miR-21-3p表达明显降低。血清miR-182-5p、miR-21-3p表达降低是脓毒症患儿并发AKI 的独立危险因素。血清miR-182-5p、miR-21-3p 预测脓毒症患儿并发AKI 的敏感度及特异度均较高，可能作为脓毒症患儿并发AKI的预测指标。但本研究纳入的样本量较少，且为单中心研究，尚需多中心大样本进一步研究证实，同时本研究仅分析了患儿血清相关指标的变化，后续仍需进一步分析miR-182-5p、miR-21-3p 在脓毒症并发AKI中的作用机制。