CRISPR-Cas系统在结核分枝杆菌研究中的应用进展

杨瑞芳 李传友

近年来，随着结核病患者例数的增加，以及耐多药结核分枝杆菌(multiple drug-resistanceMycobacteriumtuberculosis，MDR-MTB)和广泛耐药结核分枝杆菌(extensively drug resistantMycobacteriumtuberculosis，XDR-MTB)菌株的广泛流行，结核病的防治形势愈发严峻[1]。尽管宿主细胞中存在多种不同的免疫应答机制以抵抗MTB，但是MTB也进化出了相应的生存机制，从而对抗宿主细胞的杀伤作用。然而，截至目前MTB的致病机制以及与宿主的相互作用等诸多问题却并没有完全明确，而且目前基于MTB疫苗和新型药物的抗结核治疗的研发进展极为缓慢。因此，临床上对结核病的诊断和治疗仍然面临着巨大的挑战。目前亟需建立一套完善且快速高效的MTB遗传操作系统，对于深入研究MTB基因的功能，了解MTB的致病及耐药机制，寻找耐药基因，进而开发新型抗结核药物和疫苗具有重要意义。

成簇的规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)最初源于Ishino等在分析大肠埃希菌中的碱性磷酸酶的同工酶(isozyme-converting alkaline phospatase，Iap)基因进行核酸序列分析时被发现[2]，但当时并未引起国内外研究者的重视。直到2002年，研究者通过生物信息学方法在细菌和古细菌基因组中找出相似且广泛存在的短重复序列及其间隔序列相关的基因，并将此种序列命名为“成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)”，与其相关的蛋白编码基因命名为CRISPR相关基因(CRISPR associated genes，Cas)[3]，在此基础上，CRISPR的相关研究才逐渐展开。目前，CRISPR-Cas系统主要以细菌抵御外源DNA入侵时产生的自我保护机制为研究热点。根据CRISPR-Cas系统中Cas基因种类的多样性以及Cas蛋白作用机理的不同可以分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型[4]。其中，Ⅲ型CRISPR系统主要存在于古细菌中，系统较为复杂，主要有A、B两种类型，而MTB的CRISPR-Cas系统属于Ⅲ-A型[5]，参与抗结核的免疫应答反应。近年来，随着对CRISPR-Cas系统的深入研究，发现该系统可能与调控MTB毒力表达、耐药及定向基因编辑方面存在一定的关系[6-7]。笔者就近年来CRISPR-Cas系统在MTB免疫和生理调控研究中的应用进展进行综述。

CRISPR-Cas系统对MTB的免疫调控机制

CRISPR-Cas系统是由前导区(leader)、重复序列(repeat)、间区(spacer)及CRISPR周围相关蛋白组成，Cas基因编码构成多种具有不同生理功能的Cas蛋白。不同的物种具有不同的前导区和重复序列，是因为前导区可作为CRISPR转录时的启动区和转录因子的结合位点，而CRISPR位点有多个重复序列，但它们都有一个共同特征，即均有一个回文结构，重复序列之间存在间区[8]。MTB中的CRISPR系统都有2个CRISPR位点[9]，一个具有24个重复序列，而另一个具有18个重复序列。由于这两个CRISPR的重复序列不同。因此，它们属于两个不同的CRISPR位点。

CRISPR-Cas系统介导的免疫保护机制发挥主导作用，可以裂解MTB，保证宿主细胞的正常功能。此外，CRISPR-Cas系统还可以激活特异性免疫记忆应答，预防同类外源DNA的再次入侵[10-13]。主要包括3个阶段：(1)适应阶段：主要获取间隔序列并将其整合到CRISPR基因座。CRISPR系统会在前导序列与第一段重复序列之间插入一段与外源性基因片段同源的短DNA片段，同时伴有重复序列的复制。(2)表达阶段：新的间隔序列整合到CRISPR基因座后，经转录产生长前体crRNA与crRNA加工成熟的阶段，具体表现为这一前体crRNA在重复序列处被剪切，并被Cas内切酶加工成短小的crRNA，然后与Cas蛋白结合形成Cas-crRNA作用复合体。(3)干扰阶段：在crRNA的指导下靶向定位与裂解外源性核酸[11-13]。

CRISPR-Cas系统对MTB生理功能的调控

一、CRISPR-Cas系统用于转录调控和基因编辑

近年来，国内外研究者发现CRISPR-Cas系统可用于干扰目的基因的转录，而研究最多的是Cas9，且当Cas9的内切酶结构域发生突变时，会因失去核酸内切酶活性而产生无活性的Cas(dCas9)。dCas9一方面可以通过结合到基因的启动子序列或者与转录抑制因子结合，从而抑制转录过程。另一方面，dCas9也可以与转录激活因子结合而激活基因的转录[14-16]。此外，刘雅婷[17]发现Cas6和Cas10也参与了crRNA的加工过程。Cas2是一种保守的RNA内切酶，存在于含有CRISPR的MTB基因组中，可以编码基因Rv2816c的转录，且随代谢抑制剂的治疗而变化，如抗生素和应激剂等[9,18]。此外，Zhang等[18]研究通过将Cas6开放阅读框(ORF)上游的197 bp的DNA片段克隆到无启动子的β-半乳糖苷酶基因(lacZ)报告子质粒中，并将该Cas6-lacZ报告子质粒转化到BCG wildtype(WT)和Rv2837c(cnpB)缺失株(△cnpB)中，发现cnpB可以控制结核分枝杆菌复合群(MTBC)的CRISPR-Cas系统的转录，且通过一种高度保守的3′-5′寡核苷酸酶控制crRNA水平。

目前，基因编辑被认为是生物研究中较常用的可以促进基因鉴定和表征的一种有效技术。近几年来，CRISPR-Cas9系统作为新一代的基因编辑技术，研究愈发热门，它属于Ⅱ型 CRISPR系统。CRISPR-Cas9系统通过两种RNA和一种Cas蛋白精确地对双链DNA进行切割，从而实现基因编辑[16,19]。因此，未来在基因编辑和转录调控上，CRISPR-Cas9系统将发挥更大的作用。同时，CRISPR-Cas9系统靶向的准确性以及产生DNA双链断裂的效率也促进了基因编辑和基因治疗的发展[20-21]。此外，来自细菌的CRISPR-Cpf1系统也已被开发为高效的基因编辑工具[22]。

Yan等[23]通过改进非同源末端连接修复通路，并开发了一种基于CRISPR切割和非同源末端连接修复途径的基因组编辑工具。与传统的方法相比，它可以有效地在MTB中同时产生双突变和大规模的基因突变。因此，他们预计这种CRISPR-NHEJ辅助的基因组编辑系统将在MTB研究、疫苗开发和药物靶点分析等方面具有深远的应用价值。Rock[24]发现从嗜热链球菌中提取的Cas9酶在耻垢分枝杆菌中具有优异的性能特征，因此开发了一种优化的CRISPR干扰(CRISPRi)系统，用于MTB的靶向基因沉默。在这个系统中，dCas9-sgRNA复合物与靶基因结合，通过阻断RNA聚合酶启动子通路或转录延长而影响转录过程。他们提出，基于CRISPR新的功能，基因组的应用可能会产生一个更强大的结核病抗生素发现平台，从而有助于实现MTB基因组测序，以及开发全新的抗结核药物[24-25]。此外，部分研究发现CRISPRi方法不仅可以在MTB中实现多基因靶向调控，也可以对其他高危险性的非结核分枝杆菌(NTM)实现基因调控，这些结果为MTB基因组特征的全面认识，明确致病机制提供新的方案与思路[26]。另一方面，国外研究指出，噬菌体疗法结合CRISPRi可能成为一种新的有效解决方案来应对MDR-MTB、XDR-MTB菌株的不断出现[22]。Singh等[27]通过对141个分枝杆菌基因组进行了比较分析，表明MTBC北京谱系CRISPR-Cas系统可能是由于插入序列IS6110的转位所致，提示CRISPR-Cas系统可能在决定MTB不同谱系中也发挥着至关重要的作用。另一方面，Zhang等[28]在体外利用引物延伸方法，发现CRISPR-Cas系统Csm1(一种Ⅲ-A型 CRISPR-Cas系统效应复合物中的重要蛋白，具有核酸酶活性)可以有效地延伸DNA引物链，提出MTB Csm1具有DNA聚合酶活性。

二、CRISPR-Cas系统对MTB毒力的调控

Cas2(Rv2816c)——一个已经被报道的，可以在间区获得过程中发挥重要作用的保守RNA核酸内切酶，参与了逃避巨噬细胞免疫过程。国外一项研究表明，嗜肺军团菌的Cas2是侵染宿主不可或缺的重要因素，后猜测Cas2可能与MTB毒力及一些生理过程存在一定的关系[29]。而国内黄琴琴[10]通过研究证明，Cas2的过表达使耻垢分枝杆菌单菌落形态发生改变，生长速率加快，影响生物膜的形成和滑动能力，以及降低耻垢分枝杆菌在巨噬细胞中的存活率等，因此他们也推测Cas2可能与其毒力相关。

Csm5(Rv2819c)和Csm4(Rv2820c)表达的两种Cas蛋白属于同一类蛋白家族。国外学者对Rv2820c分别进行体内和体外研究，发现两种实验中均可以促进MTB的毒力[30]。此外，Rindi等[31]通过比较基因组学后，发现Csm5在MTB减毒株H37Ra中的表达量与在MTB标准株H37Rv中相比较，出现明显下调，提示Csm5可能与MTB的毒力存在一定关系。这种同源基因表现出不同表型差异的现象以及发生毒力改变是未来结核病研究的热点。

吴晓丽[32]通过制备抗Csm3多克隆抗体，发现Csm3作为MTB CRISPR-Cas系统中的一种分泌蛋白，能够帮助细菌抵抗巨噬细胞的吞噬，从而提高细菌毒力。此外，他们的研究结果发现Csm3并不能引起巨噬细胞的凋亡，但是可以引起较弱的T细胞反应，可见，CRISPR-Cas系统不仅与MTB的毒力有关，还可能与宿主免疫相关。

三、CRISPR-Cas系统对MTB耐药性的调控

MDR-MTB和XDR-MTB菌株的出现和传播增加了结核病治疗的难度。同时，也使开发新的有效的抗结核药物更加具有挑战性[1]。因此，利用噬菌体特异性感染分枝杆菌进行结核病治疗已成为MDR-TB和XDR-TB的一种新的治疗方法。但在治疗过程中，MTB对噬菌体的耐药性迅速上升严重影响治疗效果[33-34]。Cas1是Cas家族中最保守的蛋白质，是一种金属依赖的DNA特异性内切酶，可以将间隔基整合到CRISPR序列中[33]。不同细菌属的Cas1显示出相关但不同的生化特性，更为有意义的是发现Cas1的缺失可能和耐药性相关[35]，然而，Brudey等[36]发现北京谱系MTBC 即使在敲除Cas1基因后仍然是结核病高发地区非常成功的病原体。Wei等[7]重点研究了Ⅲ-A型CRISPR系统和Cas1的功能，发现抗生素或环境刺激可以使Cas1缺失株更容易转变为持留状态，使MTBC最终发展为耐药菌的可能性增加，而这个结果提示Cas1可能参与MTB的耐药性和应激反应。Cas1作为CRISPR-Cas系统的重要相关蛋白，尽管在其他细菌或肿瘤中的作用已经得到了深入的研究，但对于MTBC的研究还不完全清楚。因此，关于Cas1功能的进一步研究仍然具有重要的意义。

综上所述，CRISPR-Cas系统已广泛应用于MTB的表达调控、耐药基因和遗传修饰等多方面，提示其在未来MTB生物学研究领域中具有强大的影响力。此外，随着CRISPR-Cas系统的临床应用逐渐成熟，将为结核病的临床诊断、新型抗结核药物和疫苗的研究提供一种新的思路。但依然需要对CRISPR-Cas系统进行深入研究，不断探讨和发现该系统的潜在功能，深入了解MTB的致病和耐药机制，为结核病的治疗策略提供更多理论依据和技术支持。