TGF-β1/CTGF信号通路及其在黄韧带肥厚中作用机制的研究进展

杨信强，陈锋，闫乾，范晓茜，梁雄钦，高森

(1.广西中医药大学研究生院，南宁 530001； 2.广西中医药大学附属瑞康医院脊柱外科，南宁 530001)

腰椎管狭窄症是导致下腰痛的常见原因之一[1]。自1913年埃尔斯伯格首次描述黄韧带肥厚导致腰椎管狭窄症及其相关神经症状以来，黄韧带肥厚已被确定为引起腰椎管狭窄症的主要原因之一[2]。相关研究表明，增生的黄韧带表现为退化或弹性纤维的丢失以及胶原纤维的增加、钙化、骨化和软骨间变性[3]。黄韧带肥厚是一种与年龄、活动水平和机械应力程度密切相关的多因素疾病[4]。转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)是黄韧带肥厚变性过程中的主要因子[5]。有研究表明，TGF-β1是组织纤维化发病的关键因素，在腰椎管狭窄症的增生性退行性黄韧带组织中高表达[6]。然而，TGF-β1与黄韧带肥厚之间的分子生物学机制，尤其是与黄韧带细胞中胶原蛋白表达的关系尚不完全清楚[7]。

近年来有研究发现，肥厚的腰椎黄韧带细胞中结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)表达水平高于正常黄韧带细胞[6]。CTGF作为促纤维化因子参与黄韧带组织纤维化过程，如细胞增生、转移、黏附和细胞外基质积累[8]。据报道，CTGF还参与TGF-β1的生物活性，如TGF-β1与CTGF结合已被证明可调节细胞增殖和细胞外基质组分的合成[9]。TGF-β1还可诱导人皮肤成纤维细胞中CTGF信使RNA(messenger RNA,mRNA)的表达。因此，TGF-β1/CTGF信号通路在黄韧带增生肥厚过程中发挥重要作用，但TGFβ1/CTGF信号通路调控分子的作用机制目前仍不清楚。现就TGF-β1/CTGF信号通路在黄韧带肥厚中的作用机制进行综述。

1 TGF-β1/CTGF信号通路概述

TGF-β1/CTGF信号通路是人体细胞内信号转导的重要通路之一，在人体各组织器官的纤维化过程中均起重要作用。如在肝损伤过程中，肝细胞活化会导致TGF-β1合成增加，随着纤维化程度加重，可在各种多形肝结构中发现CTGF过量产生[10]。在卵巢疾病，如卵巢囊肿周围组织纤维化过程中，同样发现TGF-β1、CTGF及细胞外基质等因子表达升高[11]。在肺纤维化过程中，有学者发现干扰素γ-1b可明显降低TGF-β1和CTGF的mRNA表达，从而改善肺组织的纤维化程度[12]。在黄韧带细胞中，TGF-β1可促进CTGF表达，进而导致Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维的表达升高[13]。

1.1TGF-β1/CTGF信号通路 黄韧带纤维化是一个复杂的过程，机械损伤、缺氧和年龄增加等均可激活各种引起黄韧带纤维化的信号通路，TGF-β1是一种广泛存在于人体组织细胞的纤维化因子，参与黄韧带组织损伤修复、纤维化增生肥厚的病理过程[14]。TGF-β1可促进黄韧带间质细胞产生胶原纤维，特别是对Ⅱ型胶原的生成发挥重要作用。而CTGF作为TGF-β1信号通路的重要下游效应分子，对促进黄韧带细胞的增生和胶原纤维的合成发挥重要作用[6]。TGF-β1/CTGF信号通路间主要有两条转导通路：①TGF-β1/Smads/CTGF信号通路，该通路主要通过TGF-β1激活Smads依赖和非依赖途径进行信号转导，继而Smads蛋白将信号转导至细胞核内，激活CTGF的启动基因，在细胞核内转录成mRNA，并在胞质中合成CTGF相关蛋白，进一步对纤维化相关信号进行转导；②TGF-β1/促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)/CTGF信号通路，其包含胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)1、ERK2、p38、c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)4条通路。目前研究认为，黄韧带纤维化与p38 MAPK通路关系密切，4条通路之间可相互抑制、相互协同，共同调节TGF-β1/MAPK/CTGF信号通路的信号转导[15]。因此，在黄韧带肥厚过程中TGF-β1/Smads/CTGF信号通路和TGF-β1/MAPK/CTGF信号通路共同参与TGF-β1/CTGF信号通路的信号转导，在黄韧带肥厚增生和纤维化过程中发挥重要作用。

1.2TGF-β和CTGF信号分子 目前研究发现TGF相关的分子共有5种亚型：TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4和TGF-β5，但在哺乳动物体内仅发现3种确定的结构亚型：TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3[15]。TGF-β1、TGF-β2在骨骼中占比较高，而TGF-β3在间充质干细胞分化形成的细胞中比例较高[13]，从结构上分析，这3种亚型的结构存在一定同源性，而且在功能上存在一定的相关性。TGF-β1是损伤修复过程中作用最显著的因子之一。TGF-β1是与人体免疫系统相关，由体内的免疫和非免疫细胞通过分泌的方式产生的一种多肽，其分泌方式分为自分泌和旁分泌等，该物质具有“激素样活性”的特征和属性[14]。TGF-β1的结构是同质二聚体的形式且无活性，同时，TGF-β1可与前体相关的蛋白结合，使其与细胞表面受体相结合从而介导生物学效应[16]。

TGF-β1与CTGF之间可相互影响，CTGF是TGF-β1下游的效应分子。卢昌怀等[6]研究首次发现在黄韧带发生损伤早期，黄韧带细胞释放的TGF-β1可对CTGF发挥调控作用，TGF-β1通过影响CTGF的表达协同促进黄韧带增生和纤维化，外源性TGF-β1可促进CTGF、胶原纤维的表达。而加入CTGF阻断剂后，CTGF及胶原蛋白的表达水平均下降。因此认为，在机械应力导致的微损伤情况下，黄韧带细胞通过释放TGF-β1促进CTGF蛋白表达，进而促进胶原蛋白的生成，导致黄韧带组织纤维化。曹延林[13]研究发现，抑制CTGF蛋白表达可降低细胞外基质中Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白和纤维连接蛋白水平，同时TGF-β1的表达也降低，因此认为CTGF的表达水平影响TGF-β1在黄韧带细胞中的功能，两者相互影响。有研究认为，大多数TGF-β1的表达涉及一定水平的CTGF参与，如细胞外基质成分的刺激，成纤维细胞、成骨细胞、星形胶质细胞的增殖，以及伤口愈合和纤维化等[17-18]。CTGF被认为是目前纤维化因子中成纤维活性最强的因子之一，TGF-β1对CTGF表达的调控是Smads蛋白家族和MAPK蛋白家族共同参与的结果[19]。

1.3TGF-β1/Smads/CTGF信号通路 目前Smads蛋白家族被认为至少包含9个成员，分别是Smad1～Smad8以及Smad10，根据功能不同可分为受体激活型(R-Smad)、受体通用型(Co-Smad)和受体抑制型(I-Smad)三种。R-Smad包含Smad1/2/3/5/8，Co-Smad包含Smad4/10，而I-Smad包含Smad6/7[20]。Smads家族蛋白对纤维增生的形成和细胞外基质沉积有促进作用，与纤维增生性瘢痕中的过度增殖、分化、迁移和凋亡等生理病理过程密切相关[21]。Smads家族蛋白是TGF-β1下游的一种重要信号分子，可在TGF-β1的作用下进行激活，将TGF-β1分子信号通过细胞表面的受体传递至细胞核内[22]。一般认为TGF-β1/Smads是一种简单、线性的信号转导通路。

TGF-β1/Smads/CTGF信号通路是TGF-β1发挥生物效应的一条重要通路，TGF-β的作用是通过细胞质Smads蛋白的磷酸化来介导[23]。TGF-β家族蛋白通过与两对跨膜激酶、Ⅰ型和Ⅱ型受体的四聚体细胞表面复合物结合启动细胞内信号转导[24]。TGF-βⅡ型受体可识别并结合TGF-β，但无法激活Smad2/3，而Smad2和Smad3是参与TGF-β信号通路的主要分子，TGF-βⅠ型受体能激活Smad2/3，但不能结合TGF-β，因此，TGF-β先与TGF-βⅡ型受体结合，通过Ⅱ型受体激活Ⅰ型受体，进而通过胞质Smad2/3的磷酸化进行介导，为TGF-β的蛋白信号转导提供基础[25]。有研究发现，在CTGF的启动子上存在Smads蛋白的结合位点，提示Smads信号转导通路可能参与TGF对CTGF表达的调节[15]。

1.4TGF-β1/MAPK/CTGF信号通路 除激活Smads信号通路外，TGF-β1还能激活MAPK通路中的成员和其他相关酶[26]。MAPK通路参与细胞增殖、分化、凋亡以及肥厚等病理生理过程，同时在创伤愈合过程中也发挥重要作用。MAPK通路激活机制的一个重要线索是可被蛋白酪氨酸磷酸酶CD45或蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶PP2A灭活[27]。MAPK可将细胞外膜刺激产生的信号通过跨膜转运传递至细胞核内，从而在细胞的基因表达、增殖、分化以及对外部环境的应激中发挥重要作用[28]。机械创伤、活性氧类等均可促进MAPK通路激活[29]。

近年来研究发现，CTGF的表达受到MAPK通路的调控。MAPK信号通路是TGF-β1进行信号转导的另一条重要通路。目前在哺乳动物的细胞中发现4条与MAPK相关的信号通路：ERK1、ERK2、p38、JNK通路；前3条通路是促纤维活性信号，而JNK通路则是抑制纤维活性功能的信号[30]。ERK1通路在MAPK通路研究中是最早被发现的信号通路，也是 MAPK已知通路中最主要的信号通路，ERK信号通路主要由5种蛋白激酶(ERK1～5)构成，目前研究最广泛的为ERK1/2。多种细胞外刺激可激活ERK信号通路，激活途径主要是Ras、Raf、丝裂原活化ERK(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase，MEK)、ERK。Ras是Raf的上游激活蛋白，当多种细胞外刺激(如机械损伤、活性氧类及炎症因子刺激)激活ERK通路后，Ras开始活化并与其受体结合，进一步激活细胞膜上的Raf。激活后的Raf与信号通路中的“枢纽”MEK结合，磷酸化MEK后激活MEK。MEK活化后磷酸化TEY基，使ERK活化。而活化后的ERK转移至细胞核内，激活相关核酸和转录因子，通过影响细胞的转录和表达调节细胞功能[31]。ERK2信号通路是最新发现的一个MAPK通路，Schwebs等[32]研究发现，ERK2缺乏会导致叶酸和cAMP趋化性的完全丧失，表明ERK2在MAPK信号通路的转导过程中不可或缺，Ras/Raf可能参与ERK2通路的调节。JNK通路存在3种亚型：JNK1、JNK2及JNK3。JNK通路又被称为应激活化蛋白激酶信号通路，可以被多种应激因子激活，如脂多糖、肿瘤坏死因子-α、氧化应激。活化后的JNK进入细胞核与转录因子相结合，参与相应基因的表达[33]。

2 TGF-β1/CTGF信号通路在黄韧带肥厚中的作用机制

在黄韧带增生肥厚过程中各种因素均可导致TGF-β1和CTGF高表达，两者又协同促进黄韧带细胞中胶原纤维的表达。其中TGF-β1/Smads/CTGF和TGF-β1/MAPK/CTGF信号通路在黄韧带增生、肥厚过程中发挥重要作用，尤其是p38 MAPK通路目前被认为是调控CTGF表达的关键通路，对选择性阻断TGF-β1/MAPK/CTGF信号通路、抑制黄韧带肥厚增生发挥重要作用。

2.1TGF-β1和CTGF在黄韧带肥厚中的作用机制

2.1.1TGF-β1与黄韧带肥厚 在黄韧带细胞中，由于脊柱的机械应力刺激，TGF-β1被激活，活化的TGF-β1与其受体相结合，通过特定的异四聚体受体复合物发出信号，激活经典的Smads信号通路和MAPK信号通路以及一些小的GTP酶活化，进而激活纤维化基因表达，如编码细胞外基质和平滑肌肌动蛋白相关基因[34]，这些基因的表达导致胶原蛋白表达增强，特别是Ⅱ型胶原纤维的蓄积增生，而Ⅱ型胶原纤维的显著增生可能是导致黄韧带增生、肥厚的重要原因之一[35]。目前TGF-β1在黄韧带组织发生纤维化过程中的作用机制以及在损伤、炎症以及纤维化过程中的分子机制尚不完全明确[7]。

2.1.2CTGF与黄韧带肥厚 CTGF是富含半胱氨酸的基质蛋白，参与生物细胞的调控过程。近来研究发现，在腰椎肥厚的黄韧带中CTGF高表达，且在黄韧带肥厚进程中发挥重要作用，卢昌怀等[6]将正常黄韧带组织和发生增生肥厚的黄韧带组织细胞进行细胞外基质培养并进行比较，结果显示，增生肥厚组中的CTGF水平高于正常组，且CTGF的表达水平与增生肥厚程度呈正相关。CTGF是一种促纤维化因子，参与人体多种组织器官的纤维化过程，同时也参与新生血管形成、组织创伤修复等[36]。

2.2TGF-β1/Smads/CTGF信号通路与黄韧带肥厚 Smads通路在黄韧带组织损伤的修复、愈合以及瘢痕形成中扮演重要角色，是细胞纤维化过程中TGF-β1进行信号转导的主要通路。当黄韧带细胞受到机械应力等因素刺激时，可通过自分泌或旁分泌的形式释放TGF-β1，活化的TGF-β1通过与特定的受体相结合激活Smads信号通路，Smad2/3被激活后，将信号由细胞膜外转导至细胞核内，Smads蛋白通过结合CTGF的启动子激活CTGF蛋白表达，进而促进胶原蛋白生成，当黄韧带细胞受到过度刺激时，CTGF出现过表达，最终导致黄韧带增生和纤维化[37]。但并非所有细胞CTGF的表达均通过Smads信号通路应激上调。有研究发现，Smads通路作用广泛，特异性不明显[38]。

2.3TGF-β1/MAPK/CTGF信号通路与黄韧带肥厚

p38 MAPK通路被认为是MAPK的经典通路，在TGF-β1调控CTGF的过程中特异性最显著[39]。p38 MAPK一般位于细胞质和细胞核，p38 MAPK通路主要参与细胞核的作用，主要体现在细胞生长、凋亡过程中的信号转导。同时在细胞的炎症调控和应激反应也发挥重要作用[40]。

当各种因素(如机械应力、年龄增长、微损伤)刺激使黄韧带发生退变时，黄韧带细胞中的TGF-β1增加，导致TGF-β1激活Smads信号通路，进一步促使Smad2/3活化。活化后的Smad2/3是TGF-β激活激酶1的上游激酶，TGF-β激活激酶1被激活后进一步激活MAPK激酶6/MAPK激酶3，从而激活p38 MAPK信号通路。p38 MAPK被激活后形成磷酸化p38 MAPK，其具有多种细胞功能，如参与多种转录因子的磷酸化、细胞表面受体的表达、多种蛋白的合成和细胞骨架重构等。磷酸化p38 MAPK进一步活化，形成p38 MAPK，最终使细胞信号通过p38 MAPK通路传递至细胞核内[41]。由于MAPK信号通路的激活和Smads蛋白的磷酸化可相互独立发生，TGF-β1调节CTGF表达的过程可能是Smads通路和MAPK通路共同作用的结果。

在黄韧带肥厚的细胞信号转导中，p38 MAPK通路一旦被抑制可直接影响TGF-β1/MAPK/CTGF信号通路的转导过程。曹延林[13]在研究p38 MAPK通路介导的腰椎黄韧带肥厚增生实验中，通过对不同MAPK信号通路进行阻断，发现ERK和JNK通路阻断后，CTGF mRNA、Ⅰ型胶原mRNA和Ⅲ型胶原 mRNA表达不受影响，而加入p38阻断剂后，上述3种mRNA的表达水平受到明显抑制，说明p38 MAPK通路是影响TGF-β1调控CTGF表达的关键通路。而加入TGF-β1后受到抑制的CTGF表达再次上调，说明在黄韧带细胞中TGF-β1通过p38信号通路调节CTGF的表达。但需要注意的是，该实验中可能有其他信号通路参与TGF-β1对CTGF的上调，如Smads信号通路。

3 小 结

在人腰椎黄韧带细胞损伤修复、增生肥厚以及瘢痕形成过程中，TGF-β1/Smads/CTGF和TGF-β1/MAPK/CTGF信号通路均参与黄韧带细胞的信号转导，促使CTGF表达增加，进而诱导细胞外基质(如胶原蛋白、纤维连接蛋白和糖蛋白)的产生，引起黄韧带细胞纤维化，从而导致黄韧带细胞肥厚退变。由于Smads通路作用广泛，特异性较差，目前研究普遍倾向于通过阻断p38 MAPK通路选择性地抑制CTGF蛋白表达，推测敲除p38 MAPK基因或使用p38 MAPK特异性阻断剂阻断p38 MAPK信号通路可减少CTGF蛋白以及相关胶原纤维等的产生，从而减少黄韧带细胞肥厚的发生。