牦牛瘤胃和肠道微生物多样性及影响因素研究进展

信金伟,姬秋梅*(1.省部共建青稞和牦牛种质资源与遗传改良国家重点实验室，西藏 拉萨 850000； 2.西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所，西藏 拉萨 850009)

牦牛(Bosgrunniens)是中国青藏高原的特有牛种，为当地人民提供肉、乳、皮毛和燃料等生产生活资料，在高原生态系统中扮演着重要角色，具有重要的社会、生态和经济价值[1]。为适应高原上低温、低氧和强紫外线辐射的恶劣环境，牦牛进化出了独特的适应机制以获得更高的植物纤维素利用率。因低温、高海拔、温差大和降水不均等特点[2-3]，青藏高原的植被以天然高寒草甸为主，草甸每年4月返青，8月达到生物量巅峰，11月枯萎，牧草资源匮乏。与低海拔地区的黄牛相比，牦牛的氮排泄量相对较低，对摄入氮的利用效率更高[4]；在相同饲养条件下，牦牛的氮保留量比本地黄牛更高，表明牦牛能更有效的吸收和利用氮元素，是其适应青藏高原严酷环境的重要机制之一[5]。

瘤胃是反刍动物特有的消化器官，主要功能是降解纤维素，可帮助牦牛适应高原贫瘠的草原环境[4，6]。瘤胃中含有大量的细菌、真菌、古菌和原虫，各种微生物协同发酵植物饲料，分解成宿主能利用的短链脂肪酸和蛋白[2]。为了提高牦牛的纤维素消化率和饲料利用率，有必要对瘤胃微生物的组成和功能作深入了解[7-9]。肠道是微生物共生的另一重要器官，是动物体吸收消化营养物质的主要场所。肠道微生物近十年来被报道与多种疾病相关，如炎症性肠病、肥胖、代谢综合征、肠癌、糖尿病、阿尔兹海默症、抑郁症等[10-16]，已成为共生微生物的研究热点和重点。肠道菌群可产生多样的小分子代谢产物(短链脂肪酸等)，通过肠道神经系统和外周循环系统直接或间接参与并调控宿主的物质代谢、免疫反应，并构建黏膜屏障抵御病原微生物的入侵[17-20]。鉴于瘤胃肠道微生物对维持瘤胃肠道环境的稳定以及宿主健康起着至关重要的作用，深入了解牦牛瘤胃和肠道微生物组成及其变化规律，对提高牦牛的生存能力、个体健康和生产效率具有重要意义。

1 牦牛瘤胃和肠道微生物多样性

牦牛消化和代谢与其他反刍动物具有很大的差异，能够更加高效的降解纤维素，同时排出更少的甲烷。相关研究表明，瘤胃和肠道菌群稳态对牦牛的正常生长、代谢和营养转化效率具有重要作用。牦牛瘤胃内部的细菌(1011～1012CFU/mL)、古菌(107～109CFU/mL)、真菌(104～106CFU/mL)和原虫(103～105CFU/mL)，在稳态情况下紧密协作消化植物纤维，为宿主提供能量[21]。其中，细菌是瘤胃和肠道的主要微生物，亦是本文探讨的重点。由于99%的微生物不可培养[22-23]，伴随高通量测序技术和环境基因组分析技术的发展，越来越多的瘤胃和肠道微生物在非可培养技术层面得以研究[24-28]，并取得了一定进展。

1.1 牦牛瘤胃细菌多样性

瘤胃在反刍动物消化方面具有重要作用，目前关于牦牛胃肠道共生微生物的研究主要集中在瘤胃菌群方面。由于生存环境、饲养方式和摄入营养源的差异，不同品种的反刍动物会产生不同种类或数量的瘤胃菌群。An等[29](2005年)采用16S rRNA基因克隆文库构建的同源分析法，研究了牦牛与晋南牛(Bostaurus)的瘤胃微生物多样性差异，结果表明，牦牛瘤胃细菌以低G+C含量的革兰氏阳性细菌(LGCGPB, 54.12%)和拟杆菌门(Bacteroidetes, 30.93%)为主，晋南牛瘤胃细菌主要由拟杆菌门(39.59%)、γ-变形菌门(γ-Proteobacteria,26.9%)和LGCGPB(22.34%)组成；同时，在牦牛瘤胃中检测到的10.8%序列与已知瘤胃纤维分解菌属有关，而在晋南牛瘤胃中则有4%和17.8%的序列与纤维分解类和淀粉分解类微生物有关。鉴于相关研究可知，因独特的生存环境和青藏高原短暂的牧草期，牦牛为高效转化植物纤维并储存能量，其瘤胃微生物进化富集了更多关于纤维分解的菌群。因此，研究牦牛瘤胃微生物组成、功能和相关适应机制，对畜牧业的推进具有重要作用。

随着测序技术的发展，关于牦牛瘤胃微生物多样性的研究开始兴起，越来越多的新物种和功能被发现。Kim等[30](2011年)发现厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为反刍动物瘤胃细菌的绝对优势门类； Henderson等[31](2015年)在属的水平上发现拟杆菌门中的普氏菌属(Prevotella)为反刍动物瘤胃中的绝对优势菌属，具有分解蛋白的作用。Guo等[32](2015年)采用16S rRNA基因高通量测序，将操作分类单元(OTUs)扩大至7200个，对6头四川甘孜的成年雄性牦牛瘤胃的样品进行了分析，为该地区相关研究提供了更全面的数据；该研究共鉴定出40个OTU属于古菌(0.56%)、6 642个OTUs属于细菌、518个OTU为新的未鉴定原核生物，共23门和159科，其中拟杆菌门(39.68%)和厚壁菌门(45.9%)为优势门。Xue等[9](2016年)结合16S rRNA基因文库构建，发现牦牛瘤胃原核生物隶属于29门、40纲、63目、77科和79属，其中97.7%为细菌，优势种群为拟杆菌门(59.1%)、厚壁菌门、变形菌门和纤维杆菌门；优势菌属为普氏菌属，占牦牛瘤胃原核生物属中的28.5%，低于该属在奶牛中的比例(50%以上)。普氏菌属被报道均有广泛生物学功能，在日粮蛋白的初步分解和半纤维素的高效利用具有重要作用，因此研究普氏菌属对牦牛饲料利用的作用，可对该菌属和其代谢产物进行益生菌、益生元的开发，有望进一步提高牦牛的饲料利用率。

另外，牦牛相较其他反刍动物有更少的甲烷排放量，这个现象也在牦牛瘤胃微生物多样性中得到了验证[33]。反刍动物瘤胃除了将饲料分解成短链脂肪酸外，还产生H2和CO2，这些副产物的不断累积会对植物纤维的利用产生反馈抑制效应。为了提高纤维利用率以抵御严寒缺草的时节，牦牛瘤胃富集了更多的产甲烷菌，利用CO2和H2合成甲烷(CH4)，同时有其他机制再利用甲烷降低其排放[34]。Xue等[9](2016年)的研究通过产甲烷古菌特异性序列mcrA基因构建克隆文库研究牦牛瘤胃古菌多样性，发现古菌占原核菌群的2.26%，其中甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae, 82%)、甲烷热球菌科(Methanomassiliicoccaceae)和甲烷八叠球菌科(Methanosarcinaceae)为优势种群，甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)为优势菌属。张学燕等[35](2018年)对牦牛瘤胃固液相(瘤胃食糜和瘤胃液)进行了甲烷菌多样性分析，发现甲烷短杆菌属(63%)为古菌中的优势属。这些结果提示，甲烷短杆菌属对牦牛甲烷的合成和排放量具有重要作用，值得进行可培养菌群的研究，为探索反刍动物甲烷减排机制和提高饲料能量利用率提供参考。

1.2 牦牛肠道细菌多样性

动物肠道是宿主动物从食物资源中获取营养物质和水分的主要部位，共生着数量庞大、种类繁多的原核微生物。肠道菌群目前被报道参与调节宿主的多个代谢途径，菌群稳态与失衡对免疫炎症、肿瘤、肥胖、糖尿病、抑郁症的发展和调节等具有重要作用[36-37]。目前，关于牦牛肠道微生物多样性的研究仍处于起步阶段。Nie等[38](2017年)采用变性梯度凝胶电泳(DGGE)和宏基因组测序技术研究了牦牛结肠微生物群落结构，超过85%的rRNA基因序列属于厚壁菌门和拟杆菌门；基因功能分类显示，大多数编码酶基因与纤维素消化和氨基酸代谢途径有关。尚立强等[39](2019年)发现高海拔地区双峰骆驼、绵羊和白牦牛的粪便微生物在门水平上具有一致性，优势群体主要是拟杆菌门、厚壁菌门、纤维杆菌门、变形菌门、螺旋体门(Spirochaetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)和广古菌门；而拟杆菌属、Alistipes、普氏菌属和纤维杆菌属为3种动物肠道微生物优势属。Zhang等[40](2019年)对牦牛肠道微生物详细划分后进行了16S rRNA高通量测序，结果显示，门水平上从十二指肠到盲肠的优势菌群呈现均一性，依次为厚壁菌门、拟杆菌门和变形杆菌门，但各菌群的相对丰度存在显著差异。

基于目前研究结果，牦牛肠道内微生物群落以厚壁菌门、拟杆菌门和变形杆菌门为主，与人类和其它哺乳动物的肠道微生物菌群相似[41-42]。厚壁菌门和拟杆菌门主要负责碳水化合物和蛋白质的消化[43]；而变形杆菌门具有高度多样化的代谢功能，在高海拔寒冷的环境下有利于牦牛对高能量和营养的需求[43]。瘤胃菌科常见于反刍动物瘤胃和后肠，能够降解纤维素和淀粉。但与其它反刍动物不同的是，牦牛肠道内还存在Romboutsia、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)和琥珀酸弧菌属(Succinivibrio)[40]，这说明牦牛肠道微生物为适应高原环境演化出了独特的菌群多样性。这些研究结果表明牦牛肠道菌群种类丰富且不同肠道部位各具多样性特征和对应的功能，因此对牦牛肠道菌群进行深入研究，能够帮助我们了解肠道菌群和瘤胃菌群的关系以及对宿主的影响。

2 牦牛瘤胃和肠道微生物群落结构的影响因素

饲料成分、生存环境和年龄等因素都会影响反刍动物瘤胃肠道微生物菌群结构[44]。了解各因素对牦牛瘤胃和肠道菌群的影响，可为牦牛营养调控、改善环境适应力和免疫调节等提供理论指导。因此，深入了解日粮与微生物组成之间的相互作用，可以调节牦牛瘤胃肠道功能，提高免疫力，改善饲料的使用、提高生产效率和生长性能。

2.1 饲料成分

刘开朗等[45](2009年)对鲁西肉牛、荷斯坦牛、晋南牛、牦牛、黄牛和Hanwoo 6个品种牛进行了瘤胃微生物分析，结果表明宿主品种以及对应品种的饲养方式是影响瘤胃细菌群落结构组成的重要因素。牦牛的主要饲料和饲养方式依赖于青藏高原，其草场主要为高寒草甸型，牧草生长时间短，枯草期长，牧草饲用价值受季节变化影响很大。因而牦牛瘤胃肠道微生物群落会相应的随着饲料成分发生季节性变化。Ma等[46](2019年)研究了返青期、青草期和枯草期对牦牛瘤胃微生物群的影响,返青期牧草粗蛋白含量最高(13.22%)，而枯草期牧草中性洗涤纤维含量最高(59%)，因而返青期牦牛瘤胃微生物多样性和丰度最高。马力等[47](2019年)发现，牦牛瘤胃液氨态氮、乙酸、异丁酸、丁酸、总挥发性脂肪酸含量均在青草期最高，厚壁菌门丰度显著高于返青期和枯草期，然而瘤胃微生物整体多样性及丰度却最低；拟杆菌门、厚壁菌门和普氏菌属的相对丰度在3个物候期均较高；在种水平上，瘤胃微生物以纤维素降解菌为主。

由于高原草甸的营养成分变化(粗蛋白、短链脂肪酸及纤维)，目前较为成熟和常用的饲料补充方式是添加控释尿素作为氮源补充，有提高蛋白质利用率、稳定瘤胃环境和节约饲料的作用[48]。Yan等[49]研究了高低两种控释尿素水平对牦牛瘤胃微生物的影响。其结果表明，所有牦牛的瘤胃微生物以拟杆菌门(63.2%)、厚壁菌门(24%)和变形杆菌门(5.63%)为主，主要真菌类群为复膜孢酵母属(Saccharomycopsis，22.44%)、念珠菌属(Candida，5.26%)和Pseudopithomyces(3.32%)；饲喂低控释尿素水平组牦牛日平均增重和饲料利用率优于高水平组牦牛；分析微生物多样性差异发现，控释尿素添加显著降低了瘤胃中绿菌门(Chlorobi)、理研菌属、毕赤酵母属(Pichia)、地霉属(Geotrichum)和明梭孢属(Monographella)的丰度。由此可见，控释尿素可影响牦牛瘤胃微生物多样性和群落组成，这些差异富集的菌群对调整饲料有重要作用。

另外，随着畜牧业向规模化、集约化发展，部分地区牦牛的饲养方式已从天然放牧转为半舍饲和舍饲，牦牛瘤胃肠道微生物群落结构也会发生相应的变化[50]。曹连宾等[51](2016年)采用16S rRNA高通量测序技术分析了不同饲养方式下牦牛瘤胃细菌多样性，发现放牧牦牛的瘤胃厚壁菌门比例比舍饲牦牛高(79.52% vs 62.79%)，拟杆菌门比例低(19.27% vs 25.58%)；纤维降解菌丰度差别不大；但舍饲牦牛瘤胃内的蛋白降解菌和淀粉降解菌比放牧牦牛更丰富，提示人为干预饲料成分，如添加氮源等能够改变瘤胃菌群。Zhou等[52](2017年)研究了天然放牧、放牧+补饲和舍饲3种饲养方式对牦牛瘤胃微生物的影响。在门水平上，3种饲养方式的牦牛瘤胃细菌均以拟杆菌门(51.06%)和厚壁菌门(32.73%)为主；在属水平上，放牧组和放牧+补饲组的普氏菌属的相对丰度高于舍饲组，而放牧组的瘤胃球菌属(Ruminococcus)相对丰度则低于放牧+补饲组和舍饲组。整体上，不同饲养条件下牦牛瘤胃细菌群落结构不同，而古细菌群落结构基本相同。Xue等[6](2017年)采用舍饲和放牧两种方式饲养藏羊和牦牛,研究发现，两种饲养方式下4组间厚壁菌门、纤维杆菌门、变形菌门、螺旋体门和TM7存在显著差异；舍饲牦牛组变形杆菌门和纤维杆菌门的丰度最高，厚壁菌门丰度最低；放牧组的甲烷球形菌属(Methanosphaera)和Shuttleworthia的丰度显著高于舍饲组，且甲烷微球菌属(Methanimicrococcus)只存在于放牧组；而舍饲组的Succiniclasticum、YRC22和Moryella的丰度则显著高于放牧组。

以上结果表明，牦牛瘤胃微生物群落组成与饲料成分存在显著相关性，虽然不同饲料情况瘤胃主要优势菌门相同，但种属水平上利用不同营养的功能菌群在发生变化，适应特定的饲料成分和食源环境。这些变化的菌群将是研究的重点，如筛选富集植物利用率高、甲烷排放量小的牦牛个体中区别于其他个体的优势功能菌属作为益生菌；或采用代谢组学分析得到功能菌属的短链脂肪酸等作为益生元添加到饲料中，对调节瘤胃肠道功能和减少甲烷排放等方面具有至关重要的作用。然而目前缺乏饲料成分与牦牛肠道微生物的相关研究，忽视了肠道微生物在牦牛营养摄取和吸收的作用，加快这方面的研究能够完善对牦牛共生微生物的消化作用认识，增强相关饲养水平。

2.2 年龄

年龄也是造成牦牛瘤胃/肠道微生差异的因素之一。Nie等[38](2017年)比较了0.5岁、1.5岁和2.5岁牦牛结肠微生物组成，发现年龄对三者肠道微生物组成有显著影响，尤其是0.5岁与1.5岁牦牛之间，厚壁菌门、拟杆菌门、黏胶球形菌门(Lentisphaerae)、软壁菌门(Tenericutes)和蓝藻(Cyanobacteria)的相对丰度差异更大。Wang等[53](2017年)的研究表明，老年牦牛(10.7±0.6岁)瘤胃中甲烷杆菌纲(Methanobacteria)、甲烷杆菌目(Methanobacteriales)、甲烷杆菌科和甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)的丰度明显高于成年牦牛(5.3±0.6岁)。聂召龙等[54](2019年)比较了幼年牦牛(1岁)和成年牦牛(4岁)的瘤胃微生物多样性，在属水平上，普氏菌属和瘤胃球菌属在幼年牦牛瘤胃内的相对丰度均高于成年牦牛(4.69% vs 2.68%，4.69% vs 1.79%)。

可见，牦牛瘤胃肠道微生物群会随着年龄的变化而改变。幼牛在成长的过程中，可能会因为食源由高消化率的牛奶转变为低消化率的草，导致负责蛋白质降解的菌群减少，而负责降解纤维素的菌群则增加[38]，乃至成年时其瘤胃肠道微生物形成稳定的生态系统。当牦牛衰老，则可能由于器官衰老等原因导致摄食量低于壮年牦牛，进而导致了瘤胃肠道菌群的差异化[53]。目前，关于年龄与牦牛瘤胃肠道微生物菌群的研究仍然有限，稳定的菌群对宿主的健康至关重要。探索不同年龄下牦牛瘤胃肠道微生物优势菌群的组成结构，一方面有利于了解瘤胃肠道微生物的稳态机制，另一方面可为不同年龄牦牛瘤胃肠道微生物的长期调控奠定基础。

2.3 性别

大量研究表明，人类和啮齿类动物肠道菌群多样性与性别有关。有报道称人体微生物受性激素调节，青春期后女性肠道微生物多样性明显高于男性。然而性别对反刍动物瘤胃和肠道微生物多样性的影响鲜有报道。韩雪平等[55](2020年)通过16S rRNA基因测序和Tax4Fun功能分析，成年公牦牛瘤胃微生物多样性指数Sobs高于母牦牛，尤其是与植物纤维降解相关的微生物丰度差异明显，包括普氏菌属在公牦牛中丰度更高。但目前尚不清楚性别如何影响牦牛的胃肠道微生物多样性。母牦牛的营养状况与犊牛初生重和成活率具有重要作用，因此未来对性别影响进行深入研究，有助于按照性别不同对牦牛进行精准饲养，指导添加不同益生菌、益生元或饲料调整。

2.4 疾病

腹泻是牦牛最常见的疾病之一，严重影响牦牛的生长发育，会影响其生殖力、产奶量和体重，尤其是围产期牦牛在发生腹泻后，胎儿会因营养不良和脱水而死亡[56]。牦牛肠道菌群紊乱和失衡会引发腹泻。Han等[57](2017年)研究了腹泻对围产期牦牛肠道粪便菌群数量和结构的影响，发现腹泻组牦牛肠道菌群在门、纲、目、科、属水平上的群落组成则存在显著差异。Li等[58](2018年)比较了3头健康成年公牦牛、3头腹泻成年公牦牛和3头腹泻牦犊牛的粪便样本；在门水平上，健康牦牛与腹泻牦牛新丽鞭毛菌门(Neocallimastigomycota)相对丰度存在显著差异；在属水平上，健康成年牦牛与腹泻成年牦牛有23个属存在显著差异，健康成年牦牛与腹泻犊牛有28个属存在显著差异，而腹泻成年牦牛则与腹泻犊牛有23个属存在统计学差异。了解牦牛病理期瘤胃肠道菌群变化，找到与疾病密切相关的菌群，有利于牦牛疫病防治，增加犊牛存活率，避免因犊牛死亡引起的重大经济损失。

综上所述，牦牛瘤胃肠道微生物的群落组成受到饲料、饲养方式、年龄以及健康状况的影响。干净卫生、营养均衡的饲料有利于稳定牦牛瘤胃肠道菌群；枯草期饲料中补饲及增加氮摄入有助于牦牛的生长。牦犊牛常因为腹泻而死亡，为提高牛犊存活率，牦牛瘤胃和肠道内菌群与疾病之间关系的研究仍需加强。牦牛瘤胃肠道微生物组成复杂多变，在饲养牦牛的过程中需综合考虑各潜在因素对牦牛的影响。

3 展 望

共生于反刍动物胃肠道中的微生物组与宿主形成稳定的互利互惠关系，其稳态与宿主的正常生长和健康息息相关。随着生物技术的快速发展，胃肠道微生物组与宿主之间的相互关系和调控机制被逐渐揭示，但反刍动物胃肠道微生物组尤其是肠道微生物的组成和功能尚不明确。对牦牛瘤胃肠道微生物群及其功能的定位、区分特定微生物的生态位、确定种群多样性、并探索微生物组与宿主之间的关系，将是今后牦牛瘤胃肠道菌群研究的主要方向。鉴于此，加强饲料成分、饲养方式和年龄等因素对瘤胃肠道微生物群落系统发育和功能的深入研究，找到对牦牛饲喂具有重要意义的差异富集微生物、对应功能和对应代谢产物，通过添加益生菌、益生元等食源干预的方法来调控瘤胃微生物群落将是提高饲喂水平的有效策略。同时，了解健康或疾病下微生物与宿主的交互作用，可避免动物抗生素的使用，降低微生物的耐药性，减少环境污染，并为牦牛疾病的早期检测、防疫和治疗提供依据。最后，了解牦牛胃肠道微生物组成与功能，对牦牛养殖向高产化、高效化和高质化发展，推进畜牧业牦牛养殖的发展，对促进牦牛系列产品开发并满足人民需求，具有重要意义。