1α,25-二羟基维生素D 检测方法的研究进展*

周 莉，张 杨，田 来，张玉琪，罗 镧

(南通大学附属医院老年医学科，南通 226001)

1α,25-二羟基维生素D[1α,25-dihydroxyvitamin D,1α,25(OH)2D]是一种类固醇激素衍生物，主要有1α,25(OH)2D3、1α,25(OH)2D2两种形式。人体内1α,25(OH)2D 是由维生素D 经两次羟基化反应生成。首先皮肤或膳食来源的维生素D 经血液或淋巴系统运输至肝脏，在25-羟化酶作用下生成25(OH)D，随后25(OH)D 被肾脏1α-羟化酶转化为1α,25(OH)2D。当体内1α,25(OH)2D 足量时，1α,25(OH)2D 主要经肾脏24-羟化酶代谢生成1α,24,25(OH)3D，最终在胆汁中被分解[1]。上述1α,25(OH)2D 的合成代谢受磷、钙、甲状旁腺激素、成纤维细胞生长因子-23(fibroblast growth factor-23,FGF23)等多个调节因子的调控，因此临床上即使发生维生素D 缺乏即25(OH)D＜20 ng/mL,1α,25(OH)2D 循环水平也能通过严格调节基本维持在正常范围内[2]。

然而1α,25(OH)2D 水平也会出现异常，尤其在发生维生素D 代谢紊乱相关疾病时，此时检测1α,25(OH)2D 水平是鉴别诊断的关键。例如，维生素D依赖型佝偻病Ⅰ型和Ⅱ型均出现低钙血症和早发性佝偻病，但Ⅰ型由于1α-羟化酶失活表现为低浓度1α,25(OH)2D[3]，而Ⅱ型由于维生素D 受体(vitamin D receptor,VDR)先天性缺陷表现为高浓度1α,25(OH)2D。类似情况同样表现在低磷血症，FGF23 介导和非FGF23 介导的低磷综合征患者，1α,25(OH)2D 浓度截然相反[4-5]。1α,25(OH)2D 除了具有维持体内钙磷稳态的经典作用，还具有调节免疫、抑制肿瘤、保护神经等多种作用[6-7]，因为1α-羟化酶在免疫细胞、神经细胞、前列腺上皮细胞等许多细胞中也有少量表达。然而长期大量补充外源性1α,25(OH)2D 药物可能会产生高钙血症、异位组织钙化等不良反应，早期检测1α,25(OH)2D 循环水平可辅助评估维生素D药物疗效，有效防止维生素D 中毒。此外，对于结节病、炎症性肠病及淋巴增殖性疾病等疾病，检测1α,25(OH)2D 能解释其合并高钙血症的原因[8]。

鉴于1α,25(OH)2D 水平具有重要的临床价值，而其血循环浓度极低，仅为25(OH)D 的千分之一，因此1α,25(OH)2D 定量是临床化学分析最具挑战和意义的课题之一。本文综述了生物样本中1α,25(OH)2D检测方法并给予评价，重点介绍了液相色谱串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)的应用，拟为临床疾病的诊疗及维生素D 代谢组学研究、选择合适的1α,25(OH)2D 测定方法提供依据。

1 1α,25(OH)2D 检测方法

综合以往建立的1α,25(OH)2D 检测方法，分为竞争性蛋白结合法(competitive protein-binding assay,CPBA)[9]、免疫法、LC-MS/MS。CPBA 以1α,25(OH)2D与VDR 的高度亲和力为基础，由于操作步骤极其繁琐，已逐渐被淘汰。目前常用的方法主要有LC-MS/MS 和免疫法。

1.1 LC-MS/MS LC-MS/MS 结合了液相色谱的分离能力和质谱的高选择分析能力，能区分1α,25(OH)2D3、1α,25(OH)2D2，更适应临床精准定量的需求。LC-MS/MS 可同时测定多种维生素D 代谢物，有利于维生素D 代谢组的研究，近年来成为1α,25(OH)2D 定量分析的热点方法。但色谱质谱仪器及维护费用高，需要专业技术人员的支持，限制了其临床应用。实际操作中，为了降低生物样本基质效应，改善1α,25(OH)2D 电离性能，以提高检测灵敏度和特异性，LC-MS/MS 检测必须进行样本前处理(包括样本提纯和样本衍生化)以及色谱质谱条件优化。

1.1.1 样本提纯 大部分方法先用乙腈等强有机溶剂沉淀蛋白质，使1α,25(OH)2D 与维生素结合蛋白(vitamin D-binding protein,VDBP)解离。再应用液液萃取(liquid-liquid extraction,LLE)或固相萃取(solid-phase extraction,SPE)提纯样本。D.B.WAN等[10]提出先LLE 后SPE 的提纯方法，1α,25(OH)2D2、1α,25(OH)2D3回收率均≥85%，而且质谱的离子抑制效应比单独SPE 降低了50%左右。但LLE、SPE 耗时费力，为此设计出相对便利的新型萃取技术——在线固相萃取(online SPE)[11-12]和固相支持液液萃取(solid supported liquid-liquid extraction,SLE)[13]。N.S.ABU KASSIM 等[11]介绍了简单快速的online SPE 提取血清中12 种维生素D，online SPE 采用可重复使用的五氟苯基保护柱，该柱不仅可以纯化萃取物以减少质谱基质效应，还能延长分析柱的使用寿命，1α,25(OH)2D 回收率可达93%左右。C.JENKINSON等[13]应用SLE 定量10 种维生素D 代谢物，由于SLE以性质稳定、高比表面积的硅藻土为载体，采用96 孔板格式，处理步骤少，在不影响分析物回收率的情况下大大缩短样本制备时间。也有研究[14]在质谱分析前使用免疫管直接免疫亲和萃取样本，显著降低了基质效应，1α,25(OH)2D 总体回收率高达95%。

1.1.2 样本衍生化 LC-MS/MS 离子源的电离效率是影响质谱分析的重要因素。而1α,25(OH)2D 缺乏可电离的极性基团，在质谱的电喷雾电离(electroapray ionization,ESI)模式下离子化效率低。P.A.ARONOV等[15]提出应用4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5 二酮试剂(PTAD)，与1α,25(OH)2D 反应生成富含氮原子的衍生加合物，该加合物在ESI 模式下易形成加氢峰[M+H]+，显著提高了分析灵敏度。X.T.DUAN 等[16]先将样本与PTAD 孵育，再应用选择性SPE 和微流液相色谱(microflow liquid chromatography,μLC)提纯分离，可使1α,25(OH)2D 定量下限达5 pg/mL，但需要较长的色谱时间(约27 min)。另外还有报道[10,17-18]使用PyrNO、Amplifex、DAPTAD 等衍生试剂。D.B.WAN等[10]应用PyrNO 试剂测定5 种维生素D 代谢物，样本仅需100 μL，在多反应监测模式下PyrNO 衍生化后检测灵敏度比PTAD 提高了10 倍。Amplifex 试剂由于存在季胺基团，衍生化产物更易离子化，且定量离子受到的内源性干扰更少。C.J.HEDMAN 等[18]比较了Amplifex 和PTAD 的衍生化性能，结果显示Amplifex 衍生产物的峰面积显著高于PTAD，定量下限为2 pg/mL，优于PTAD 方法，但Amplifex 试剂价格昂贵。也有研究[13-14,19-20]不使用衍生化提高电离效率，但往往需要更精细的样本提纯方法(如免疫纯化)、更大的样本体积(＞0.5 mL)、更复杂的LC-MS/MS 系统(如μLC 或2D 色谱)，否则根本达不到理想的定量下限。B.CASETTA 等[19]使用复杂的二维液相色谱系统提纯样本，其中灌注柱用于在线样本提取，两个串联的18C 柱用于分离1,25(OH)2D 和同分异构体，最终定量下限达15 pg/mL，生理浓度下变异系数(variable coefficient,CV)为5～15%。而同时应用免疫纯化和衍生试剂制备样本通常可获得最理想的定量下限[21-22]。

1.1.3 色谱质谱条件优化 超高效液相色谱法(ultra-high-performance liquid chromatography,UPLC)具有高速度、高分辨率及高灵敏度的特点，目前UPLC-MS/MS 是维生素D 代谢物分析的首选技术。超临界流体色谱法(ultra-performance supercritical fluid chromatography,UPSFC)在检测分辨率上更具优势，但C.JENKINSON 等[23]发现其1α,25(OH)2D 定量下限较高，为80 pg/mL，可能和UPSFC 的进样量太少有关。1α,25(OH)2D 的质谱分析常用三重四极杆质谱仪、四极线性离子阱质谱仪(quadrupole linear ion trap,Q-Trap)。多应用正离子电喷雾电离，定量离子的正确选择会影响检测灵敏度。有研究[24]在流动相中添加醋酸锂生成稳定的[M+Li]+，显著改善了1α,25(OH)2D的信号噪音比值，经高灵敏度的API6500 Q-Trap质谱仪分析，1α,25(OH)2D 定量下限达10 pg/mL，总CV、批内及批间CV 均＜10%。也有研究[25]为了放大检测峰信号，将甲胺加入流动相，形成丰富的[M+CH3NH3]+，定量下限为20 pg/mL。

同分异构体干扰是LC-MS/MS 检测中容易出现的问题。因同分异构体与母离子分子量相同，碰撞电离产生相似的子离子，质谱无法辨别，导致1α,25(OH)2D 测定结果偏高。Z.C.WANG 等[26]研究发现4β,25(OH)2D3干扰峰，浓度与1α,25(OH)2D3相当，可通过优化色谱条件提前洗脱4β,25(OH)2D3。另有研究[27]发现1β,25(OH)2D3广泛存在于人体血清中，浓度与血清25(OH)D 呈正相关。生物样本中除了各种位置异构体，还存在立体异构体[3-epi-1α,25(OH)2D][28]，因此在测定1α,25(OH)2D 时，应注意选择合适的色谱条件，如洗脱液、洗脱梯度等，使1α,25(OH)2D 与同分异构体完全分离。

1.2 免疫法 1α,25(OH)2D 免疫法灵敏度较高，对操作人员的要求相对不高，因此仍占据临床检测的主体地位。主要包括放射免疫法(radio immunoassay,RIA)、酶免疫法(enzyme immunoassay,EIA)、化学发光免疫法(chemoluminescenceimmunoassay,CLIA)。

1.2.1 RIA RIA 是抗原抗体相互反应至平衡状态时，根据抗体上结合的放射性抗原量，推算出样本抗原浓度。1996 年B.W.HOLLIS 等[29]创造性地以125I-1α,25(OH)2D 为示踪剂，无需测定单个样本回收率评估内源性损失；同时以高碘酸钠预处理生物样本，使24,25(OH)2D、25,26(OH)2D 转化为醛或酮形式，显著降低了抗体与维生素D 类似物的交叉反应。DiaSorin 公司和IDS 公司在上述方法基础上，设计出试剂盒形式的RIA，大大简化了样本处理步骤，且检测灵敏度高，检测下限可达5 pg/mL，是目前实验室最常用的免疫法。DiaSorin 和IDS 对1α,25(OH)2D的提取方法上有所不同。DiaSorin 先乙腈提取再固相萃取样本；而IDS 直接使用固相免疫亲和萃取样本再回收1α,25(OH)2D，无需有机溶剂，但需要样本孵育过夜及2 d 的检测程序。DiaSorin 和IDS 试剂盒抗体对1α,25(OH)2D2的特异性有所差异，分别为100%和91%[30]。C.YUAN 等[14]用RIA 和LC-MS/MS 法分别检测了40 例样本，结果显示RIA 与LC-MS/MS 相关性差，平均偏差达27.1%，考虑与RIA 交叉反应相关。RIA 还存在一些固有局限，如不能区分1α,25(OH)2D3和1α,25(OH)2D2，且放射性物质对实验人员及周围环境存在一定风险。

1.2.2 EIA EIA 是将抗体结合至固相载体上，利用抗原抗体特异性结合，进行定量的非放射性免疫法。IDS 公司开发的酶免疫测定试剂盒IDS-EIA，与DiaSorin RIA 操作类似，且所需样本量更少。IDS-EIA是通过样本与生物素标记的1α,25(OH)2D 竞争结合绵羊单克隆抗体，根据酶催化底物生成的有色产物颜色深浅推算目标物浓度。该方法可以与自动化的比色检测系统结合，具有节省人力、减少污染等优势，但1α,25(OH)2D2反应性只有39%；同时酶促反应受洗板程度、反应温度等影响，批内批间精密度偏差较大[30]。D.WAGNER 等[31]使用脂质提取-EIA 法，检测患者结肠标本中1α,25(OH)2D 浓度，为后续研究奠定了基础。

1.2.3 CLIA 全自动CLIA 是目前免疫法发展的方向，分析仪主要由DiaSorin 和IDS 提供。DiaSorin-LIAISON CLIA[32]设置的反应条件有利于1α,25(OH)2D与VDR 结合，使VDR 产生空间构象，而25(OH)D、24,25(OH)2D 等保持与VDBP 优先结合。鼠单克隆抗体特异性识别VDR 构象，并与1α,25(OH)2D 发生免疫反应，最后根据化学发光的光信号强度与1α,25(OH)2D 成正比分析数据。此方法实现了完全自动化检测；所需样本容量少(75 μL)，灵敏度高，检测下限达1.57 pg/mL；精密度良好，批内、批间CV 分别为3.5%、4.5%；检测结果与LC-MS/MS 方法相关性良好。IDS-ISYS 的1α,25(OH)2D 测定含自动化的脱脂和免疫纯化步骤，利用含抗体的磁性颗粒富集样本中的1α,25(OH)2D。研究[33]显示IDS-ISYS 定量结果比IDS RIA 平均低20.4%。K.SPANAUS 等[34]比较了全自动IDS-ISYS、Diasorin-LIAISON 及LC-MS/MS分析方法。结果显示，DiaSorin 测定的1α,25(OH)2D浓度与LC-MS/MS 测定浓度有很好的相关性。相比之下，IDS-ISYS 检测血清中1α,25(OH)2D 的检测下限偏高，在较高浓度时CV 高达20.1%，远远超过DiaSorin 的＜5.2%。有研究[35-36]应用全自动CLIA 测定健康成人和儿童1α,25(OH)2D 的参考区间，但报道的区间范围广，与1α,25(OH)2D 生理浓度受严格调控相悖，而且某些样本的检测结果与LC-MS/MS 检测结果差异大，可能和抗体与其他维生素D 衍生物发生交叉反应有关，这也正是免疫法一直存在的发展障碍。

2 展望

1α,25(OH)2D 测定有助于疾病的临床诊疗，尤其在区分维生素D 依赖型佝偻病类型、鉴别低磷综合征、预防维生素D 中毒等方面具有重要意义。而对于血液透析及使用维生素D2治疗等多种情况的患者，更需要区分检测1α,25(OH)2D3、1α,25(OH)2D2。目前1α,25(OH)2D 仍以免疫法为主，最新的全自动免疫法操作简便且测定迅速，但无法区分1α,25(OH)2D3、1α,25(OH)2D2。LC-MS/MS 检测凭借高特异性、高灵敏度成为1α,25(OH)2D 定量的金标准。但该法一般需进行样本前处理，包括样本提纯以提高方法灵敏度，以及样本衍生化以增强电离性能。目前国际上1α,25(OH)2D 的检测方法尚未统一。有必要参照25(OH)D 标化的方法，由国际维生素D 室间质量评价计划提供标准方法和参考值，以规范1α,25(OH)2D的检测。未来还需开发更自动化的样本提纯方法、更灵敏的LC-MS/MS 仪器，提高1α,25(OH)2D 检测的精确度，促进维生素D 代谢相关疾病的临床与科研的发展。