干细胞治疗中重度宫腔粘连的临床研究进展*

段 璇 综述，李维宏 审校

(重庆医科大学附属第一医院妇产科，重庆 400016)

宫腔粘连(IUA)是1894年由HEINRICH FRITSCH首次提出的，1948年JOSEPH G ASHERMAN发表了一系列论文对该疾病进行命名，并做出详细描述，故而又称为Asherman综合征，其定义为由于流产、反复宫腔操作或感染等原因导致宫腔部分或完全闭塞的一组疾病，表现为月经异常、不孕及反复流产[1]，多数宫腔粘连患者都伴有继发不孕。目前，宫腔粘连的一线治疗包括宫腔镜下粘连分离术(TCRA)、物理屏障防止粘连复发、雌孕激素治疗促进子宫内膜再生。尽管轻度的宫腔粘连患者通过以上的常规治疗效果尚可，然而中、重度宫腔粘连患者术后粘连复发率仍高，甚至可高达62.5%[2]。干细胞治疗的提出给这些患者带来了希望。干细胞是一类兼具强大的自我更新能力和多项增殖分化能力的细胞群体，具有免疫原性低、生物学特性稳定等特点，近年来在再生医学领域展现了良好的治疗前景。已有多项基础研究证明干细胞治疗宫腔粘连在改善内膜纤维化、增加子宫内膜厚度(ET)及促进新生血管生成方面取得了肯定的疗效[3-5]。随着基础研究的深入，已有多种来源的干细胞被应用于宫腔粘连的治疗，如骨髓间充质干细胞(BMDSCs)、月经血源性干细胞(menSCs)、脐带来源间充质干细胞(hUCMSCs)、脂肪间充质干细胞(AMDSCs)等，但这些临床研究大都处于初级阶段，尚未形成标准的治疗方法。现通过以下几方面对干细胞治疗中重度宫腔粘连的临床现状进行综述。

1 干细胞治疗宫腔粘连概述

1.1宫腔粘连的诊断和分度 2015年宫腔粘连临床诊疗中国专家共识中提出：宫腔镜检查是诊断宫腔粘连的“金标准”，可全面评估宫腔形态、宫腔粘连的范围及程度，进行宫腔粘连的分度，以指导治疗及评估预后[6]。关于宫腔粘连分度的评分标准，目前国际尚无统一共识，常用的评分标准有1988年美国生育学会(AFS)与1995年欧洲妇科内镜学会(ESGE)提出的评分量表，2015年我国专家共识中也提出了中国宫腔粘连分级评分标准，虽然标准不一，但大都是根据宫腔镜检查时肉眼所见粘连累及的范围和部位来划分，只有AFS评分不仅考虑粘连的范围和程度，还将月经模式纳入了评分标准中，因此目前使用最广泛的仍是1988年AFS评分标准，具体如下。(1)宫腔粘连范围：<1/3为1分，1/3～2/3为2分，>2/3为4分。(2)粘连类型：薄膜样为1分，薄膜与致密之间为2分，致密粘连为4分。(3)月经情况：正常0分，月经微量2分，闭经4分。Ⅰ级(轻度)评分：1～<5分；Ⅱ(中度)评分：5～<9分；Ⅲ级(重度)评分：9～12分。

1.2干细胞治疗宫腔粘连的理论基础 宫腔粘连患者子宫内膜的病理形态表现为正常内膜被无活性的单层柱状上皮和间质纤维结缔组织所替代，腺体稀少，呈无活性形态或囊样扩张，不能分辨其功能层和基底层，上皮受到激素刺激呈无反应型，缺乏新生血管，宫腔内纤维粘连形成。研究认为，正常子宫内膜随月经周期性再生是由于子宫内膜干细胞的存在，且其主要位于内膜基底层，因此当子宫内膜受到创伤或感染时导致内膜基底层受损，内膜干细胞数量减少、缺失及功能障碍，子宫内膜不能完全再生，导致内膜纤维修复，最终形成宫腔粘连，这为干细胞治疗宫腔粘连提供了理论基础，尤其给传统治疗无效的中重度宫腔粘连患者带来了希望[3]。关于干细胞治疗宫腔粘连的机制目前尚不清楚。一种说法认为与干细胞的归巢作用有关，即干细胞在归巢因子的作用下迁移到损伤部位并分化为正常的子宫内膜；已知干细胞的主要归巢因子之一是基质细胞衍生因子-1(SDF-1)，其特异性的结合干细胞表明CXC族细胞因子受体4(CXCR4)，导致干细胞定向迁移及归巢[7]，SINGH等[8]认为，干细胞到达受损部位后能够通过激活剩余的子宫内膜干/祖细胞进行增殖或替换，从而起到再生修复的作用。另一种说法认为与干细胞的旁分泌作用有关，比如干细胞可以分泌血管内皮生长因子促进子宫内膜下血管的生成；可以分泌生长因子促进受损子宫内膜组织增殖；还可以分泌抗炎因子抑制局部炎性反应，为组织修复提供良好的微环境[9]。

2 干细胞治疗宫腔粘连疗效的评价指标

在动物实验中已形成一系列较为常用的指标用于评价干细胞治疗宫腔粘连的效果，例如病理学形态(ET、内膜腺体数目、子宫内膜小血管数目等)、免疫组化(如角蛋白、波形蛋白等)及妊娠结局。而在干细胞治疗宫腔粘连的临床应用中，评估疗效的主要结局指标为临床妊娠率，大部分临床研究都报道了妊娠结局情况，但由于样本量都很少，无法通过统计分析准确得出临床妊娠率。因此，目前最常使用的临床疗效评价指标是最大ET、内膜容受性(内膜下血流分支评分、PI值及S/D值)和AFS评分，未来还需要大样本量的临床随机对照试验来准确评估干细胞治疗对IUA患者妊娠结局的影响[10]。

3 干细胞治疗宫腔粘连的给药方式及剂量选择

3.1干细胞治疗宫腔粘连的给药方式 此前常见的干细胞移植方式包括宫内灌注、宫内局部原位注射及子宫螺旋动脉推注等。但宫内灌注法难以将干细胞固定在内膜表面，流失细胞数量多，有效种植率低；宫内局部原位注射使干细胞的分布不均；通过脉管移植最终到达受损内膜组织的干细胞数量少，且有发生子宫内膜异位症、肺栓塞等并发征的风险。因此上述方法各有局限性，似乎都未能发挥干细胞的最佳作用。研究者尝试了不同方法试图提高干细胞移植的有效率，近年来有研究发现一些生物材料，如聚乳酸羟基乙酸支架(PLGA)、聚癸二酸甘油支架(PGS)、胶原支架等为干细胞提供附着点，能提高干细胞在受损部位的存活率，改善治疗效果。ZHAO等[11]使用胶原支架携带自体骨髓来源单核细胞(BMNCs)植入5例重度IUA患者宫腔使5例患者均成功受孕；2018 年CAO等[12]将负载hUCMSCs的胶原支架复合体通过Foley尿管黏附在26例中重度IUA患者的子宫内壁，最终10例患者成功妊娠，说明胶原支架使能提高不同干细胞治疗的效果，但胶原支架也存在引起超敏反应、免疫原性反应、传播疾病等风险，且价格昂贵[13]。我国肖邦等[14]研究比较了PGS支架、PLGA支架、胶原支架搭载BMSCs和局部原位注射BMSCs治疗大鼠子宫内膜损伤的效果，结果表明PGS支架提供的3D结构更有利于大鼠BMSCs的附着和生长，由于PGS支架具备良好的弹性，与不能从变形中恢复的PLGA支架及胶原支架相比，PGS支架不会对周围组织产生机械刺激，因此在子宫组织的再生应用中具有优势。2020年吴林等[15]采用hUCMSCs联合冻干羊膜作为宫内屏障，同时作为载体为hUCMSCs提供附着位点治疗中重度宫腔粘连患者，发现冻干羊膜来源丰富、成本低，且经冻干、紫外线辐照等制作过程能降低宫腔感染发生率，是替代上述生物材料的潜在选择。以上研究说明联合使用生物材料能使干细胞更好地发挥其作用，但不同生物材料间有效性的差异仍待进一步研究。

3.2干细胞治疗宫腔粘连的剂量选择 目前国际上对干细胞的使用剂量并没有达成明确的共识，KABAT等[16]对2008-2018年ClinicalTrials.gov.上记录的使用间充质干细胞的临床研究进行了综述，综合结果表明最小有效剂量(MED)的干细胞总数在1～1.5亿个。动物实验中有研究显示，当脐带间充质干细胞使用剂量超过每公斤1×107细胞体重时，食蟹猴会出现恶心、呕吐、面部水肿、发红，检测谷丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)有升高的毒性反应[17]。我国海泉等[18]比较了每公斤1×107个，5×106个，2.5×106个3个剂量的脐带间充质干细胞，反复多次静脉注射对小鼠的毒性反应，结果显示小鼠的各项检测均未出现异常。临床上使用不同来源干细胞、采用不同给药方式治疗宫腔粘连时的剂量选择均不一致，未来进行大规模临床试验之前应当预先确定MED以保证试验的安全性及有效性。

4 治疗宫腔粘连的不同来源干细胞

干细胞是一类具有强大的自我更新能力和多项增殖分化能力的细胞，根据其发育先后顺序可分为：胚胎干细胞(ESC)和成体干细胞(ASC)。干细胞在再生医学中表现出巨大潜力，是目前难治性宫腔粘连的研究热点。

4.1ASC ASC因其分化方向可控、来源广泛、较易获取的特点在临床上得到了广泛应用。目前临床上应用最广泛的ASC为间充质干细胞(MSC)，许多研究均已成功从骨髓、脂肪组织、脐带、羊膜等组织中分离出间充质干细胞并应用于临床。2006年国际细胞疗法协会制定了定义人类间充质干细胞的最低标准：在标准培养条件下具有贴壁能力；能够表达标志物CD73、CD90和CD105；2013年增加了CD29和CD44；不表达造血干细胞标志物和HLA-DR；在体外具有成脂肪和成骨的能力[19]。基于该标准每项临床研究均对间充质干细胞进行了鉴定。

4.1.1骨髓来源干细胞 BMDSCs是目前干细胞领域应用最广泛的一类细胞。多项基于宫腔粘连动物模型的研究均证实BMDSCs可增加ET、促进新生血管生成[4-5,20-22]。NAGORI等[23]于2011年首次报道了1例通过自体骨髓来源干细胞移植治疗重度宫腔粘连并成功妊娠的患者，从患者自身骨髓中分离出3.9×107个CD9、CD44、CD90阳性子宫内膜血管生成干细胞，在腹部超声引导下通过宫内灌注的方式进行移植，当患者ET达6.9 mm时通过IVF-ET成功妊娠。2014年SINGH等[8]报道了6例重度宫腔粘连患者接受自体骨髓来源单核干细胞(MNCs)治疗而没有分离出特定的表型，他们在超声引导下于患者子宫内膜下层的2～3个位点分别注入了76×106～128×106个不等MNCs，6例患者均在3个月时恢复月经，且直到9个月随访期结束时仍有规律月经，最大ET较治疗前均明显增厚，但还不足以开始IVF治疗。此后，SANTAMARIA等[24]进行了1项纳入18例患者的CD133+自体骨髓来源干细胞移植治疗重度宫腔粘连和子宫内膜萎缩症的先导队列研究，他们将患者自体外周血分离出的CD133+ BMDSCs(平均细胞数量124.39×106个)植入子宫螺旋小动脉，术后联合激素替代疗法，其中11例重度宫腔粘连患者的平均内膜厚度明显改善，3例患者自然怀孕，7例患者通过辅助生殖技术临床妊娠。2016年ZHAO等[11]使用1.0 cm×0.5 cm大小的胶原支架携带6×106个BMNCs分别植入5例重度IUA患者宫腔使5例患者均成功受孕，具体的干细胞移植方法为：在宫腔镜下通过冷刀分离粘连，并使用一种精细的刷子刮除瘢痕组织直至恢复宫腔形态，然后将胶原 BMNCs复合物铺在18F Foley导管上植入宫腔，球囊注水3 mL维持12 h后移除。

4.1.2子宫内膜间充质干细胞 近年来，许多实验研究都已证实子宫内膜中存在内膜干细胞(eMSCs)，一些研究认为eMSCs来源于骨髓，当组织损伤后，BMDSCs受炎症因子或趋化因子的介导迁移到子宫内膜，在那里它们分化为eMSCs，进而促进子宫内膜再生[25]；而另一些研究认为eMSCs与BMMSCs一样，是具有自我更新增殖、多向分化潜能的ASC[26]。相较于通过骨髓穿刺获取干细胞带来的感染风险、病人承受的痛苦及获取干细胞数量的有限，子宫eMSCs取材便利，可以通过子宫内膜活检或月经血获取，因此又称menSCs，是临床应用干细胞治疗的潜在资源。2016 年，TAN等[27]将1×106个自体月经血来源的CD44、CD73、CD90和CD105(+)间充质干细胞通过一种内套管分别植入7例重度宫腔粘连患者宫腔内，治疗后监测患者平均ET，结果显示ET明显增加，5例患者最大ET增加至7～8 mm，3例患者在治疗后自然受孕或通过辅助生殖技术成功妊娠。2019年金珊珊[28]纳入45例中重度宫腔粘连患者，于宫腔镜下取其正常内膜组织，经分离纯化得到CD29(+)、CD90(+)、CD44(+)、CD45(-)、CD34(-)、HLA-DR(-)的间充质干细胞，TRCA术后将8×106个eMSCs通过宫腔灌注植入患者宫腔，并联合使用透明质酸钠凝胶，术后随访患者ET增加，内膜容受性得到改善，最终10例患者通过辅助生殖技术实现成功妊娠。2020年HAILAN等[29]纳入12例重度宫腔粘连患者，通过自体月经血分离传代得到CD73(+)、CD105(+)和CD90(+)、CD34(-)、CD45(-)和HLA-DR(-)的干细胞，经腹超声引导下，用胚胎移植管将1×107个MenSCs植入患者子宫内膜基底层，ET由治疗前的(3.9±0.9)mm增加到治疗后的(7.5±0.6)mm，经期由(2.4±0.7)d延长至(5.3±0.6)d，当ET≥7 mm时行IVF-ET，最终临床妊娠率达41.7%。

4.1.3人脐带间充质干细胞(hUCMSCs) hUCMSCs是近来干细胞移植的“种子”细胞，许多学者通过不同方式分别从脐带血、羊膜、脐带静脉内皮下层、华通胶等部位分离出hUCMSCs。此前的动物实验已经验证了脐带间充质干细胞可以改善内膜容受性、增加ET[30]。2018 年YUN等[12]进行了1项26例中、重度宫腔粘连患者接受干细胞治疗的Ⅰ期临床试验，将负载1×107个CD105(+)、CD73(+)、CD90(+)、CD29(+)、CD45(-)、CD34(-)阴性hUCMSCs的可降解胶原支架复合体通过Foley尿管黏附在子宫内壁，结果发现患者平均ET由治疗前的(4.46±0.85)mm增加至(5.74±1.20)mm，AFS平均评分由(9.12±1.51)分降至(5.52±3.22)分，所有患者在移植后的第1个月经周期即出现经期延长、经量增多，而闭经患者治疗后恢复月经，总共有10例患者在30个月的随访期结束时妊娠，对患者行DNA短串联重复序列(STR)分析显示，再生的子宫内膜仅含有患者的DNA，证实了hUCMSCs的临床应用是安全有效的。2020年吴林[15]将1×106cm2CD29(+)、CD44(+)、CD105(+)、CD45(-)、CD34(-)、CD106(-)、HLA-DR(-)的hUCMSCs联合6 cm2大小冻干羊膜包裹的宫形节育环植入20例中重度宫腔粘连患者的宫腔，治疗后评估AFS评分显著降低，ET显著增加，其中4例患者成功妊娠。

4.1.4AMDSCs AMDSCs和BMDSCs的细胞表型、分化能力类似，且体外增值速率更快。有动物实验证实，AMDSCs可降低宫腔粘连模型大鼠的内膜纤维化程度，且有关细胞增殖的多项标志物均升高[21]。2019年KWON等[31]从患者自体脂肪组织中得到基质血管成分(AD-SVF)，没有进行细胞孵育或流式细胞术鉴定，将AMDSCs的AD-SVF通过内套管植入6例重度IUA患者的宫腔中，后续行HRT治疗，结果报道了有2例患者恢复月经，3例月经量增多，子宫内膜由(3.0±1.0)mm增至(6.9±2.9)mm,通过IVF-ET使其中1例患者妊娠，但在妊娠第9周时自然流产，这表明脂肪组织治疗可增加子宫内膜容受性，但妊娠率无明显改善。有研究发现，移植体内的AMDSCs存活时间较短，且对损伤部位的靶向性较差，这可能限制了AMDSCs的临床应用，且需要进一步研究AMDSCs对患者妊娠率的影响。

4.2人胚胎干细胞(hESCs) 与ASC不同，迄今为止尚无应用hESCs治疗宫腔粘连的临床研究。但已有基础研究表明在适宜条件下hESCs可被诱导分化为心肌细胞、视网膜上皮细胞、肝细胞样细胞、胰岛素分泌细胞和神经前体细胞等。SONG等[5]使用transwell共培养系统与细胞因子(包括EGF、PDGF-b、E2)诱导hESCs分化为子宫内膜样细胞，并将其与胶原支架一同置入子宫全层受损的大鼠模型，观察到子宫角结构和功能的恢复。胚胎干细胞虽然有强大的分化及增殖能力，但其分化方向往往难以控制，且取材不易，加之存在伦理争议及潜在的致瘤性，因此限制了其临床应用。

5 结语与展望

宫腔粘连是一种严重影响育龄期妇女身心健康的疾病，中重度宫腔粘连的治疗与预防复发成为了临床医生面临的挑战，问题的关键似乎在于如何有效促进患者子宫内膜的修复再生，因此研究者提出了干细胞治疗用于那些常规治疗无效的患者，也取得了一些积极的成果，为IUA患者带来了新的希望。

目前，临床可使用的干细胞虽然来源丰富，但同样存在各自的局限性，例如BMDSCs的细胞数量及增殖分化潜能会随着年龄增加而下降，且需行有创性操作来获取，骨髓穿刺有诸多禁忌证将限制其应用；AMDSCs的获取同样需通过有创性操作；eMSCs的组织来源通常为月经血或IUA患者的正常内膜组织，这可能加重患者的内膜损伤，而使用menSCs的研究中出现了HPV感染的情况，这提示要注意月经血来源产物的无菌性问题，且自体eMSCs培养需要一定时间[32]；hUCMSCs属于异体来源的干细胞，还需进一步评估其疗效和安全性。

综上所述，由于缺乏大样本量的临床试验，且上述研究中干细胞的获取方式、移植方式、剂量选择都不一致，无法进行有效的对比分析，尚不能形成标准化的干细胞治疗方案。即便如此，上诉干细胞治疗宫腔粘连的临床研究仍展示出了令人充满希望的应用前景，未来需要更大样本的临床试验、更全面的安全隐患评估、更精准的机制研究，相信随着研究的进一步深入，更系统有效的干细胞治疗一定会为宫腔粘连患者带来福音。