牛羊肉掺假微流控检测方法的研究

杨 柳，陈宇飞，刘长姣

(吉林工商学院粮食学院，吉林 长春 130507)

0 引言

2013年涉及欧洲16国的“马肉风波”曝光以来，肉及肉制品掺假成为世界各国共同关注的热点问题。不法商贩以鸭肉、鸡肉，甚至狐狸肉、鼠肉冒充牛肉、羊肉，严重损害消费者利益，同时带来诸多食品安全隐患。环介导等温扩增技术依靠4条引物，以及一种有链转换特性的脱氧核糖核酸聚合酶，在等温条件下，灵敏、高效、快速地进行靶序列扩增。微流控技术是通过对微通道网络内流体的操纵和控制，自动完成分析检测过程，具有体积小、消耗低、高能量等特点。

本实验以牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、狐狸肉、马肉为研究对象，将LAMP技术和微流控技术相结合，开发牛羊肉中掺假微流控检测方法。

1 材料

1.1 实验原料肉

牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉、鸭肉购于长春沃尔玛超市；狐狸肉由吉林左家特产研究所提供；马肉、鼠肉、兔肉、狗肉、驴肉、鸽子肉、鹅肉、貂肉由双阳特种动物养殖基地提供。

1.2 化学试剂及仪器

Takara试剂盒、LAMP法DNA扩增试剂盒、荧光染料、Tris-HCl、Chelex-100、甜菜碱、dNTP、Triton X-100、NP-40、琼脂糖；LA-320C型实时浊度仪、RTisochipTM-B恒温扩增微流控芯片核酸分析仪、NanoQ型分光光度计、HB-2恒温震荡金属浴、TGL-165医用冷冻离心机。

2 方法

2.1 样品核酸提取

提取牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、狐狸肉、马肉、鼠肉、兔肉、狗肉、驴肉、鸽子肉、鹅肉、貂肉等14个样品DNA作为样本，并将肉类DNA按照1-14号做好标记，在-20℃冰箱中保存备用。

2.2 靶基因序列及引物设计

通过对牛、羊、猪、鸡、鸭、狐狸、马等7种动物基因序列进行生物信息学分析，确定了16SrRNA为靶序列。根据LAMP引物设计软件，设计引物如下:羊、猪、鸡、狐狸、马各5套引物；牛、鸭各3套引物。引物合成由上海生工生物科技有限公司完成。

2.3 LAMP体系的建立

25 μL反应混合物及各组分浓度为:2.6 μL引物混合液(终引物浓度:40 pmol FIP 和BIP，5 pmol F3和B3，20 pmol LB和LF)；12.5 μL反应液(终反应液离子浓度20 mM Tris-HCl为pH 8.8，10 mM KCl，10 mM (NH4)2SO4，0.1% Triton X-100，0.8 M 甜菜碱，8 mM MgSO4，1.4 mM dNTP)；1 μL 8U Bst DNA 聚合酶；2 μL引物模板；6.9 μl 双蒸水补齐。将混合物置于65℃恒温反应60 min。

2.4 LAMP优化实验

2.4.1 引物筛选实验

设定温度为65℃，反应时间60 min，依据DNA提取实验结果，以7种肉类DNA样本为对象，进行最佳引物筛选实验，根据LAMP扩增反应起峰时间和高点浓度确定最佳引物序列。

2.4.2 特异性实验

在LAMP反应体系中，利用LAMP反应管(两组八联管)进行特异性实验。1～14号按肉核酸样本排列，15号为阴性对照，16号为阳性对照。第1组实验:1～14号加入LAMP扩增试剂和牛特异性引物，将14种肉类DNA按照标记顺序，分别加入到相应反应管中，进行LAMP特异性检测；第2～7组实验，特异性引物换成羊、猪、鸡、鸭、狐狸、马的引物，重复上述实验过程检测。

2.5 芯片验证试验

2.5.1 蝶式芯片的引物包埋固定

蝶式芯片上共有22个反应池，分成Ⅰ、Ⅱ两个区域，每个区域各有11个反应池，逆时针依次编号，其中进样口1对应的为1号反应池。1张芯片可同时检测2份样品，每张芯片在特定的反应池包埋固定1套引物，用于1种核酸靶序列的扩增与检测。

2.5.2 芯片验证试验

将牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、狐狸肉、马肉7种肉类核酸样本，根据样本编号，按照以下方式组合:单一样本，2种样本混合，3种样本混合，共20种组合方式，使用恒温扩增微流控芯片核酸分析仪进行芯片特异性验证实验。

3 结果与分析

3.1 引物筛选实验结果

根据LAMP扩增反应的起峰时间和高点浓度，可知各种肉类的最佳引物分别是:牛为N3、羊为Y4、猪为Z2、鸡为J3、鸭为ya2、狐狸为H1，马为M2。

3.2 特异性实验结果

1～14号管中加入LAMP扩增试剂和牛的特异性引物，当14种肉类核酸分别加入后，只有加入牛肉核酸的1号管中才发生扩增反应(16号管为阳性反应)；同样，将引物分别换成羊、猪、鸡、鸭、狐狸、马的特异性引物。结果显示，只有羊肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、狐狸肉、马肉的核酸才发生了扩增反应。即每种肉类的核酸，只有在与之对应的引物作用下，才能发生扩增反应，体现了引物良好的特异性。

3.3 芯片特异性验证实验结果

实验结果可知，无论是单一肉类品种的DNA，还是几种肉类混合的DNA，微流控芯片都能准确无误地检测到相应的肉源性基因的存在，体现出良好的特异性。

4 结论

本文以LAMP技术为基础，结合微流控芯片技术，研制了牛羊肉掺假检测微流控蝶式芯片。通过LAMP反应管优化实验，建立了最佳的LAMP反应体系。芯片分区点样后，做了单一核酸，2种、3种核酸混合基因芯片的特异性实验，进一步优化芯片性能。特异性实验结果显示，微流控蝶式芯片特异性良好。该芯片一次可以检测2个样本，检测通量高。