枸杞果酒发酵工艺优化及香气成分分析

李曼祎，张亚萌，刘春凤，郑飞云，钮成拓，李 崎，王金晶

枸杞果酒发酵工艺优化及香气成分分析

李曼祎，张亚萌，刘春凤，郑飞云，钮成拓，李 崎，王金晶*

(江南大学工业生物技术教育部重点实验室，生物工程学院，无锡 214122)

以宁夏枸杞为原料，分析枸杞汁初始含糖量、发酵温度、酵母接种量和SO2添加量对枸杞果酒发酵的影响。在单因素试验基础上，以枸杞多糖含量及感官品评得分为响应值，采用响应面分析法优化枸杞果酒发酵工艺。结果表明，枸杞果酒最佳发酵条件为初始含糖量230 g·L-1，接种量0.8´107cfu·mL-1，温度21.5 ℃静置发酵6 d。在此最优发酵工艺下，通过SPME-GC-MS定量及香气活度值（odor activity value，OAV）相结合的方法对枸杞酒风味物质进行分析，鉴定出正壬醇（283.51）、苯乙醇（2.19）、乙酸异戊酯（60.38）、异戊酸乙酯（2.67）等11种物质为枸杞果酒的主要风味化合物。该研究首次定量分析确定了枸杞果酒中的特征香气物质，为枸杞果酒产品的开发及品质调控提供了一定的科学依据。

枸杞果酒；工艺优化；响应面分析；风味物质

枸杞（L.）又称枸杞红实，甜菜子，属茄科落叶灌木，在我国的宁夏、青海、新疆、甘肃等地均有分布，在《神农本草经》中引为上品，是我国传统名贵中药材。枸杞子中含有的甜菜碱、枸杞色素和枸杞多糖(polysaccharide, LBP)为其主要活性物质[1-3]，具有消炎、抗疲劳、抗氧化、延缓衰老和预防肿瘤等重要的生物学功能，是食品和化妆品天然的着色物质[4]。近年来，以葡萄、水蜜桃、桑葚等水果为原料发酵的果酒深受消费者认可[5]。因枸杞独特的保健功能，枸杞相关产品的研制也日益受到研究者的关注，但其多集中于生物活性物质的提取、测定方法[6-7]及香气成分的检测[8-10]。目前市售枸杞酒大多为配制酒，因而产品的典型性欠佳、香气欠缺、口感不协调、生物活性物质含量较低。

剧柠等[11]通过筛选添加非酿酒酵母提高枸杞果酒风味，董建方等[12]以枸杞果酒的感官评定分数为响应值得出最佳发酵工艺条件为：初始糖度220 g·L-1，发酵温度18 ℃± 2 ℃，酵母接种量0.3 g·L-1，初始酸度4.3 g·L-1。目前果酒工艺优化大多以感官评定为指标，但感官仅反映个人喜好程度及酒体风味，生物活性物质含量同样是重要的品质指标。鉴于此，作者以宁夏枸杞为原料，通过响应面优化对发酵工艺进行调整并进行果酒风味物质分析，以期得到兼具保健价值与口感的枸杞果酒。

1 材料与方法

1.1 供试材料与试剂

枸杞，宁夏中宁；果酒酵母EC1118，本实验室保藏；葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、琼脂粉、5%苯酚溶液、硫酸、无水乙醇、柠檬酸、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠等，国药试剂；乙酸乙酯等（色谱纯），美国Sigma公司；白砂糖，市售。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-1CU 双人单面净化工作台，苏州净化有限公司；电子天平、AL204分析天平和精密数显pH计，梅特勒-托利多仪器有限公司；紫外-可见光分光光度计，上海天美公司；四型啤酒分析仪，安东帕公司；Trace1310ISQ LT 顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用仪，赛默飞世尔科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 枸杞果酒工艺流程

由于枸杞鲜果不耐运输，易磕碰导致霉变，且成熟时间受限，因此本试验以枸杞干果为酿酒原料。热水浸泡2 h促使枸杞干果吸水膨胀以便榨汁等后续处理且促进活性物质溶出[13]；枸杞汁中添加白砂糖及柠檬酸调节糖度及pH。本研究中果酒发酵均为带渣发酵，果汁pH为3.5；单因素及响应面试验采用1 L三角瓶进行发酵，装液量为60%，验证实验发酵体积为10 L。

1.3.2 枸杞果酒发酵条件单因素试验设计 选取无霉变、虫蛀且外形完好的枸杞干果，发酵工艺分别采用不同单一因素：初始含糖量（180、200、220、240和260 g·L-1）、发酵温度(19、22、25、28和31 ℃) 、接种量(0.6×107、0.8×107、1.0×107、1.2×107和1.4×107cfu·mL-1) 和SO2添加量(0巴氏灭菌、20、40、60和80 mg·L-1) 。待主发酵结束后测定其酒精度及多糖含量并进行感官品评，分析不同单因素对枸杞果酒发酵的影响，确定最佳单因素条件。

1.3.3 响应面优化发酵工艺 在单因素试验基础上，选择初始含糖量、发酵温度及接种量3个因素进行响应面优化试验，以果酒中枸杞多糖含量、感官品评得分为响应指标，确定枸杞果酒最佳工艺条件，因素及水平如表1所示。

表1 Box-Behnken实验设计因素与水平

1.3.4 指标测定 (1) 酒精度采用安东帕公司啤酒分析仪进行测定；总糖、总酸测定均参照GB/T 15038—2006[14]。黄酮含量测定参考吴有锋等[15]的NaNO2-AL(NO)3方法，以芦丁为标准品，标准曲线回归方程为：= 0.563 0+ 0.027 9，2=0.997 2；枸杞多糖含量测定采用苯酚硫酸法[16]，稍作修改，以葡萄糖为标准品，标准曲线回归方程为：= 9.583 2+ 0.005 6，2= 0.999 1。

(2) 感官评价。由13名经过训练并具有品评经验的专业人员对本次研究中枸杞果酒成品进行感官评价[17]，从外观、香气、口感和典型性4个方面进行品评，评分标准及细则均以表2为标准。

1.3.5 挥发性香气物质分析 采用SPME -GC-MS对枸杞果酒进行风味物质分析，样品处理及分析条件参照李凯等[18]的方法，实验均以2-辛醇作为内标。未知化合物的定性：通过与 NIST 05 质谱库中标准谱图及化合物保留指数（RI）比对来确定。定量分析：在与枸杞果酒酒精度及pH相似的缓冲液（10%乙醇，pH=3.5）中配制待测化合物标准混合液，根据化合物峰面积与内标物峰面积比值及对应物质浓度绘制校准曲线。待定量化合物浓度根据校准曲线及其峰面积相对于内标峰面积的比值进行计算。

香气活度值( odor active value, OAV)表示香气化合物实际含量与阈值的比值，通过其比值大小可以判断该种化合物对样品主体香气风格的贡献程度。通常认为≥ 1 的化合物对样品风味有贡献[19]，计算公式如下：

=ρ/OT

式中：ρ，香气化合物质量浓度，mg·L-1;OT，香气化合物阈值，mg·L-1。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

糖作为酵母生长繁殖所需要的重要底物，也是果酒酿造中酒精的来源，决定了果汁发酵后的酒精浓度，因此糖含量对发酵后的果酒中多糖溶解性和含量有一定影响[16]。由图1（a）可知，酒精度及枸杞多糖含量在一定范围内随初始糖浓度增加呈上升趋势。初始含糖量为220 g·L-1时，感官品评达到较高分数，果香较为和谐，口感协调，且此时枸杞多糖含量亦为最高。而后随初始含糖量增加，酒精度变化无显著差异(＜0.05)，可能是由于过高糖含量导致渗透压增加，影响酵母活性。此时果酒中酒精味突出，破坏整体协调感，感官品评得分下降。因此确定果汁中初始含糖量为200～240 g·L-1。

图中不同字母表示差异显著（P < 0.005）。

Figure 1 Effects of different single factors on the fermentation of wolfberry wine

温度是影响果酒发酵的重要因素，不同的发酵温度会对酵母生长造成影响，同时影响原料活性物质的溶出、营养成分及风味物质的保留[20]。如图1（b）所示，发酵温度过低，酵母起酵速度减慢，发酵不彻底，周期延长，酒精度偏低，且酶活也会受到温度影响，不利于酒精和其他香气成分的积累；温度过高，酵母迅速繁殖，发酵周期缩短，衰老速度加快，果香挥发过多，导致酒体单薄，口感偏酸，果香不突出[21]；发酵温度在22 ℃时，发酵过程平稳，发酵较彻底，酒精度可以达到预期，同时酒体圆润，口感协调，感官评分最高，且稍低的温度能更好地保留了枸杞原料的风味，感官品评中典型性分值也相应提高。由于不同温度水平下枸杞多糖含量有所差异，因此确定发酵温度为19～25 ℃。

表3 Box-Behnken实验设计及结果

适宜的接种量可以较快地启动酒精发酵，并且通过影响风味物质的产生来影响酒体的最终风味。由图1（c）可知，酵母接种量对于枸杞果酒感官品评影响较大。当酵母接种量过高时，发酵速度较快，但原料中营养物质用于酵母生长繁殖部分增加，导致生成酒精底物减少，酒精度下降。接种量过低时也无法保证酒精积累且起酵速度慢，发酵周期延长，易增加杂菌污染几率[22]。当酵母接种比例由0.6×107cfu·mL-1增加至0.8×107cfu·mL-1时，感官品评得分略有上升，然后达到最大值。而后，随酵母接种量增加，过量酵母代谢产生的副产物影响了发酵过程，不利于风味物质的形成[23]，感官品评中果酒鲜味也愈加明显，得分降低。枸杞多糖的含量随接种量增加呈下降的趋势，这可能是发酵后期酵母及其他微生物消耗或吸附沉降所致[16]，同时过量的酵母生长消耗了酒体中的单糖及双糖等寡糖, 使醇沉法提取的粗多糖含量下降[24]。因此确定接种量范围为6×106～1×107cfu·mL-1。

SO2因其具有抑制细菌等微生物生长繁殖而对酿酒酵母影响较小的特点被加入到果汁原料中以达到对酿造环境杀菌的效果，但浓度过高会使酒体产生不愉悦的硫味，且会中和化合物中游离羰基导致发酵周期延长[25]。SO2添加量为20 mg·L-1时感官品评及多糖含量最高，随SO2添加量增加，酒中硫臭味加重，感官品评得分随之下降（图1（d））。同时由于SO2添加量对枸杞多糖含量影响程度较低，因此响应面试验中不作为考察因素。

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面试验结果与方差分析 枸杞多糖由半乳糖、甘露糖、葡萄糖、吡喃糖等单糖组成[26]，多糖的提取与温度、浸提时间、pH、乙醇浓度密切相关[27]，果酒发酵过程中酒精浓度，发酵温度及果汁pH的改变综合影响枸杞多糖的浸出及保留。枸杞多糖含量是判断枸杞及其加工产品品质的重要指标，因此在单因素试验结果的基础上，采用Box-Behnken组合设计，以多糖含量及感官品评得分为响应值，以初始含糖量、发酵温度、接种量为自变量因素，进行响应面双响应值联合试验，优化枸杞果酒发酵工艺，应用Design-Expert 8.0.6数据分析软件对影响因素进行分析，试验结果见表3和表4。

由表4中的方差分析可知，两个模型均极显著（< 0.000 1），失拟项均不显著，2Adj1= 0.978 1/2Adj2= 0.976 3，证明该模型拟合度较好，具有较高的参考价值。以枸杞多糖含量为响应值时，一次项、二次项和交互项AC、BC影响较为显著，交互项AB对Y1没有显著性影响。由值可得各因子贡献率为B > A > C，即接种量> 初始含糖量> 温度。忽略影响不显著因素，得到最终预测模型：1= 932.56+ 28.44+ 35.40–16.19+40.96+13.06– 72.362– 56.322– 48.982。以感官品评为响应值时一次项A、C，交互项AB，二次项B2影响极显著，一次项B、交互项BC, 二次项A2及C2影响显著，交互项AC对Y2没有显著性影响。由值可得各因子贡献率为A > C >B，即初始含糖量>温度>接种量。忽略影响不显著因素，得到最终预测模型：

2= 86.62 + 2.95– 0.81– 1.81+ 1.65+ 1.52– 1.15 A2– 4.52 B2– 1.37C2

2.2.2 响应面分析 由各因素对指标影响的响应面及等高线结果（图2）可知，Y1模型中AB交互作用不显著，因此对AC、BC交互作用进行分析，当酵母接种量保持不变时，多糖含量随温度和初始含糖量的增加呈先上升后下降的趋势，等高线呈椭圆形，曲面较为陡峭，交互作用显著。Y2模型中交互项AB、AC的3D曲面图的侧面弧度显示，酵母接种量与初始含糖量、温度与接种量的弧度较大，且等高线均为椭圆形，说明交互作用显著。

表4 回归模型方差分析

图2 各因素交互作用对多糖含量及感官品评的影响

Figure 2 Response surface and contour plots showing the interactive effects of polysaccharide content and sensory evaluation

保健价值与口感是影响消费者购买产品的两个关键因素，应用响应面寻优方法对回归模型进行分析，选择多糖及感官品评权重均为5，分别选择两响应值最大，最优结果为初始含糖量227.85 g·L-1，接种量0.818×107cfu·mL-1，温度21.49 ℃，枸杞多糖含量预测值为933.53 mg·L-1，感官品评得分为87.77分。考虑实验操作便捷性将发酵条件参数修改如下：初始含糖量230 g·L-1, 接种量0.8×107cfu·mL-1, 温度21.5℃。在此条件下进行3次发酵体系为10 L的验证实验，枸杞多糖含量为（935.13 ± 7.95） mg·L-1，感官品评得分为（88.1 ± 0.4）分，实验值与预测值接近，证明该模型较为可靠。

2.3 枸杞果酒理化指标检测

采用最优工艺条件发酵得到枸杞果酒成品，测定指标如表5所示。结果表明枸杞果酒的理化指标及微生物指标均符合国家标准。以市售三款枸杞果酒作为比较，测定其活性物质含量，其中自酿果酒枸杞多糖及黄酮含量均远高于市售样品，基本达到预期目标。

2.4 枸杞果酒风味物质分析

采用 SPME-GC-MS 对枸杞果汁及枸杞果酒中的挥发性香气物质进行定性及定量分析，枸杞果汁及果酒的 SPME-GC-MS 总离子流色谱图见图3。通过与NIST质谱库检索及标准谱图对比分析，共鉴定出枸杞果汁及果酒中挥发性化合物70余种，主要包括了酯类、醇类、醛类、酸类和酚类，共计5类风味物质。枸杞果汁及果酒中风味物质种类有较大差别，果汁的挥发性香气物质中醛类及酮类占比较高，大多数醛酮类化合物香气描述以水果及生青味为主；枸杞果酒中香气物质主要以酯类及醇类两种芳香族化合物为主，包括酯类37种，醇类 13种，醛酮类 6种，酸类 5 种。由此可知，酵母作为影响果酒发酵的关键因素，在发酵过程中形成了大量的酯类、醇类及酸类化合物，对果酒的香气成分产生了较大影响，使果汁及果酒主体风味产生了差异。

表5 不同酒中活性物质及理化指标及活性物质含量比较

注：同一行字母表示显著性差异(< 0.05)。“—”表示没有检测到。

（a）枸杞果汁；（b）枸杞果酒。

Figure 3 GC-MS total ion-current chromatogram of aroma compounds in wolfberry juice and wine

挥发性化合物在酒中的阈值决定了其对果酒的香气贡献程度，香气活性值（OAV）表示香味物质实际含量与阈值的比值，采用香气活性值（OAV）可对化合物贡献程度进行判定。若>1则认为该化合物对果酒主体风味有贡献作用，且OAV值与其贡献作用程度成正比[23]。对GC-MS检测出的风味化合物进行定量分析，查找化合物阈值并计算OAV，将>1的化合物列出，如表6所示。

表6 枸杞果汁及枸杞果酒中香气化合物含量及其OAV值

注: 阈值参考《化合物香味阈值汇编（第二版）》及文献中报道的化合物香气阈值；“NA”表示未检测到。

由表6可知，枸杞果汁中＞ 1 的挥发性物质共有 10种，包括3种酯类、2种醇类、3种醛类及2种酸类。其中正壬醇，苯乙醇及正辛醛对枸杞果汁香气贡献程度最大；3种醛类物质虽然在果汁中含量较少但其阈值较低，对果汁主体香气风格也有较大影响，赋予枸杞果实水果香及木质香。枸杞果酒中＞ 1 的挥发性物质包括5种酯类、4种醇类及2种酸类。在枸杞果酒中含量较高的酯类为乙酯类，有乙酸乙酯、己酸乙酯、异戊酸乙酯，赋予枸杞果酒清新的花草及果香味。醇类化合物是果酒中重要的助香化合物，也是酯类合成的前体物质，由原料中蛋白质、氨基酸和糖类在发酵过程中生成[28]。枸杞果酒中对香气具有正面贡献作用的醇类有正壬醇、苯乙醇、正丙醇、异戊醇，均为一些具有花果香的化合物。酸类化合物在果酒中可起到协调香气、减少刺激感等辅助作用[29-30]，枸杞果酒中己酸及辛酸对酒体香气风格具有一定的贡献。虽然枸杞果酒中醛酮类物质含量较少，但其在维持酒体风味平衡及协调香气中起着不可或缺的作用。目前研究关于枸杞果酒香气分析多为定性分析，王琦等[9]采用HS-GC-MS法对枸杞汁发酵前后香气成分及其相对含量进行分析，在果汁及果酒种分别鉴定出13及32种化合物，这表明枸杞果汁经过发酵作用风味物质种类显著增加，与此次研究结果相符。Ouyang等[31]研究表明，枸杞酒中酯类化合物含量较高，有异戊酸乙酯、己酸乙酯、乙酸乙酯、癸酸乙酯等，与本研究通过香气活度值分析确定的酯类化合物相似，与果汁相比其含量的显著增加赋予了枸杞果酒宜人的甜香及水果香。

3 结论

果酒生产流程中工艺条件对成品质量有着至关重要的影响。本研究以宁夏枸杞为原料，通过单因素和响应面试验确定枸杞果酒最佳发酵条件为SO2添加量20 mg·L-1，初始含糖量230 g·L-1，接种量0.8×107cfu·mL-1，温度21.5 ℃静置发酵6 d。在此最优发酵工艺下，枸杞果酒的酒精度为（10.86 ± 0.14）%（vol），总糖为（5.84 ± 0.10）g·L-1，总酸为（6.12 ± 0.13）g·L-1。酒体呈金棕色略带橘调，有明显的枸杞果香，酸甜适中，风味较好，且枸杞多糖含量较高，具有一定的保健价值。通过SPME-GC-MS及香气活度值（OAV）首次定量分析确定了枸杞果酒的特征性风味化合物，为枸杞果酒产品的研发及品质把控建立了基础。

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Optimization of fermentation process and analysis of aroma components in wolfberry wine

LI Manyi, ZHANG Yameng, LIU Chunfeng, ZHENG Feiyun, NIU Chengtuo, LI Qi, WANG Jinjing

(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122)

Using Ningxia wolfberry as the raw material, the effects of the initial sugar content, fermentation temperature, yeast inoculation amount and the content of SO2on the fermentation of wolfberry fruit wine were analyzed. On the basis of single factor test, the response surface methodology was used to optimize the fermentation process of wolfberry wine. The response value was determined by the content of wolfberry polysaccharide and sensory evaluation scores. The results showed that optimal fermentation process was as follows: initial sugar content of 230 g·L-1, inoculation volume of 0.8´107cfu·mL-1, and fermentation at 21.5 ℃ for 6 days. According to the result of SPME-GC-MS quantitative and odor activity value (OAV) under the optimal conditions, 11 kinds of substances including nonyl alcohol（283.51）, phenethyl alcohol（2.19）, isoamyl acetate（60.38）and ethyl isovalerate（2.67）are the main flavor compounds of wolfberry fruit wine. This study analyzed the characteristic aroma compounds in wolfberry wine for the first time, which will provide a scientific basis for the development and quality control of wolfberry wine products.

wolfberry wine; process optimization; response surface analysis; flavor substances

TS262.7

A

1672-352X (2021)05-0865-08

10.13610/j.cnki.1672-352x.20211022.003

2021-10-25 9:29:12

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20211022.1529.006.html

2020-12-31

国家自然科学基金项目（31771963）资助。

李曼祎，硕士研究生。E-mail：3314668547@qq.com

王金晶，副教授。E-mail：jjwang@jiangnan.edu.cn