纳米银—壳聚糖材料制备及应用于机洗衣服的抑菌

强孟丹,吴剑荣,孙汉石,巫志远,詹晓北

(1. 江南大学 糖化学与糖生物技术教育部重点实验室,江苏无锡 214122;2. 无锡小天鹅电器有限公司,江苏无锡 214100)

有害微生物在自然环境中分布广泛,许多针对家用电器微生物污染的研究证实了这些污染状况会对人体健康造成一定危害[1-2]。其中我们日常使用频繁的洗衣机已被证明是微生物理想的栖息地[3],微生物和营养物质通过水或脏衣服被引入洗衣机[4],潮湿的环境和营养供应为洗衣机中的微生物提供了完美的生存条件。现存的洗衣机抗菌、除菌技术都存在一定不足[5],因此如何安全、高效的抑制、杀灭这些微生物成为待解决的一大问题。

抗菌材料是指自身能抑制或杀灭微生物的一类功能材料[6]。目前普遍将抗菌剂分为无机、有机、天然抗菌剂[7]。最常用的天然抗菌剂有甲壳素、壳聚糖、胆矾等[8]。其中壳聚糖是甲壳素脱乙酰化的产物,在自然界中来源广泛。由于其无细胞毒性、生物可降解、具有广谱抗菌等特性,在复合抗菌材料方面中得到了广泛的应用[9-10]。壳聚糖分子链上的功能基团使其在一定条件下对金属离子有螯合作用[11],在壳聚糖中添加金属极大地提高了其抗菌活性,并在许多领域展现出优异的效果。Malini等通过浇铸法制备了纳米氧化锌壳聚糖复合膜,与壳聚糖相比此复合膜表现出更强的抗菌活性[12]。Liang等发现通过控制壳聚糖/银纳米颗粒复合微球(CAgMs)尺寸可对其抗菌性能起到影响作用[13]。进一步的,许多此类的研究均证实了壳聚糖金属复合材料在抗菌领域有极好的效果[14-15]。

本研究选用天然抗菌材料壳聚糖,将其与无机抗菌剂Ag结合制备纳米银—壳聚糖(AgNPs-CTS)复合溶胶,并对复合溶胶的制备温度进行探究。通过紫外光谱、粒径对AgNPs的大小、均一程度进行测定,通过透射电镜对溶胶中的Ag颗粒的形态进行观测。进一步的将复合溶胶与含Cu的壳聚糖溶液混合,制备成AgNPs/Cu-CTS复合颗粒。对复合颗粒的机械强度、抑菌性能进行测定,并利用扫描电镜观测其表面与截面形态。将制备好的颗粒应用在洗衣机抗菌程序中,检测其在机洗过程中的抑菌效果、损耗程度。旨在制备一种天然无污染的应用于机洗过程的抗菌材料。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

壳聚糖(脱乙酰度80-95%)、硝酸银、乙酸铜、硼氢化钠、冰醋酸、邻苯二甲酸二丁酯、戊二醛(25%水溶液)、氢氧化钠、无水乙醇等,国药集团化学试剂有限公司。标准洗涤物,按照标准GB/T411要求中的漂白中平布。大肠杆菌(E.coli)ATCC-25922、金黄色葡萄球菌(S.aureus)ATCC-6538,上海保藏生物技术中心。

TB80V80WDCLG全自动洗衣机,无锡小天鹅电器有限公司;PXY-DHS-35X40隔水式电热恒温培养箱,上海跃进医疗器械厂;GI80DWS立式自动压力蒸汽灭菌器,致微(厦门)仪器有限公司;KQ-2型颗粒强度测定仪,南京科环分析仪器有限公司;SCIENTZ-10N冷冻干燥机,宁波新芝生物科技股份有限公司;U-3900紫外可见分光光度计,日本日立株式会社;ZEN3700纳米粒度及Zate电位分析仪,英国马尔文仪器有限公司;Quanta 200扫描电子显微镜,荷兰Fei公司;H-7650透射电镜,日本日立株式会社。

1.2 AgNPs-CTS复合溶胶与AgNPs/Cu-CTS复合颗粒的制备

AgNPs-CTS复合溶胶的制备参考文献[16]中的方法进行改进,称取一定质量的壳聚糖,并将之溶于体积分数为2%的醋酸水溶液,配置质量浓度为4%的CTS的醋酸水溶液,置于磁力搅拌器搅拌至壳聚糖完全溶解。量取40 mL上述配制的CTS的醋酸溶液,加入1 mL一定浓度的AgNO3水溶液,搅拌30 min使Ag+与CTS充分交联,然后加入硼氢化钠溶液作为还原剂[反应体系中n(AgNO3)∶ n(还原剂)=1∶ 1.5,确保还原反应进行完全],在60℃加热搅拌,反应至溶液颜色不再加深,自然冷却至室温,得到AgNPs-CTS复合溶胶。

AgNPs/Cu-CTS复合颗粒的制备参考文献[17-18]中的方法进行改进,将7.2 g壳聚糖与0.4 g乙酸铜溶于60 mL 4%乙酸中,然后加入40 mL AgNPs-CTS复合抗菌溶胶,搅拌均匀。加入2.5 mL邻苯二甲酸二丁酯,搅拌5 min,然后加入10 mL 0.25%的戊二醛溶液,继续搅拌10 min。溶液形成凝胶状,取合适大小凝胶揉成颗粒状,置于2 wt%的氢氧化钠溶液中浸泡3 h,用蒸馏水洗涤后,再放入50%乙醇溶液中密封浸泡2 h后,用蒸馏水洗涤至中性取出。置于烘箱干燥后得到壳聚糖多孔颗粒。

1.3 AgNPs-CTS复合溶胶的表征

1.3.1 AgNPs-CTS复合溶胶的紫外吸收光谱

采用U-3900紫外可见分光光度计对AgNPs-CTS复合溶胶进行紫外吸收光谱测定,表征不同制备条件下所得到的AgNPs的共振吸收峰。测试前,将待测样品稀释相同倍数并超声分散5 min。取一定量分散后的溶液,置于石英样品池中,待测。

1.3.2 AgNPs-CTS复合溶胶的粒径

采用ZEN3700纳米粒度及Zeta电位分析仪对AgNPs-CTS复合溶胶的粒径进行测定,表征不同制备条件下所得到的AgNPs的水合粒径。测试前,将待测样品稀释相同倍数并超声分散5 min。取1 mL分散后的溶液,置于样品池中,待测。

1.3.4 AgNPs-CTS复合溶胶的抑菌性能

采用牛津杯[19-20]法进行抑菌圈测定。将灭菌后的营养琼脂培养基液倒入培养皿中,待其凝固后移取0.2 mL稀释度为10-3的菌液涂布均匀。用镊子将灭过菌的牛津杯放入培养皿中,每个平皿中均匀地放置2只牛津杯。吸取0.2 mL AgNPs-CTS复合溶胶至牛津杯中。将培养皿置于37℃恒温培养箱培养12 h后测定抑菌圈直径,设置无菌水作为对照。

1.4 AgNPs/Cu-CTS复合颗粒的表征

1.4.1 AgNPs/Cu-CTS复合颗粒机械强度

取一定质量制备好的抑菌颗粒置于鼓风干燥箱中于60℃下干燥,失水至恒重。利用颗粒强度测定仪测定不同组颗粒的破碎强度,样品测定5次取平均值。

1.4.2 AgNPs/Cu-CTS复合颗粒平板抑菌

选取大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为代表菌种。将灭菌后的营养琼脂培养基液倒入培养皿中,迅速放入制备好的壳聚糖抑菌颗粒,待其凝固后移取2 mL稀释度为10-3的菌液涂布均匀。将培养皿于生化培养箱中37℃下培养12 h,记录抑菌圈大小。

1.5 AgNPs/Cu-CTS复合颗粒的机洗应用

1.5.1 抑菌性能损耗

将抑菌颗粒在标准程序下进行洗涤,每洗涤20次后取样,依据1.3.2方法进行平板抑菌实验,测定抑菌圈大小。以抑菌圈的大小衡量复合抗菌材料抑菌性能损耗。

1.5.2 抑菌效果检测

依据GB 21551.5-2010[21]附录AA《带有除菌功能电动洗衣机除菌试验方法》方法进行检测。

1.6 数据处理与分析

所有实验均重复3次以上,获得的值表示为平均值±标准偏差(¯X±SD)。使用软件SPSS 18.0进行单因素方差分析,基于Duncan的多重比较检验,确定值之间的差异,不同字母标注表示具有显著差异(P<0.05)。

2 结果与讨论

2.1 AgNPs-CTS复合溶胶的制备和表征

首先考察了制备条件对AgNPs-CTS复合溶胶的影响,并对其微观形态进行了表征,结果如图1所示。从紫外—可见光谱分析可以看出,所有温度下制备的样品均在400 nm～450 nm之间出现吸收峰。根据之前的研究可知壳聚糖通过氨基和羟基与银离子相互作用,AgNPs在410 nm左右处出现特征吸收峰[22-23]。随着温度的升高AgNPs的特征吸收峰逐渐增强,峰形逐渐变宽,说明所生成的AgNPs颗粒浓度增大并且粒径分布趋向不均匀。升高温度可能会提高还原反应的速度,增加反应体系中AgNPs的成核率,导致AgNPs的成核速率大于AgNPs晶核的生长速率,从而形成更多的纳米Ag颗粒。同时,反应体系中存在有大量水溶剂,水在高温时易挥发,使得反应体系中的AgNO3浓度增加,从而导致制备的AgNPs粒径较大、分布较宽。因而,本实验选择反应温度选择在60℃为制备复合抗菌剂的最佳反应温度。

图1 AgNPs-CTS复合溶胶的表征

测定不同反应温度下制备的AgNPs-CTS复合溶胶的粒径和PDI,如图1所示。粒径即为颗粒的大小,在本研究中来反映纳米Ag颗粒大小。PDI是多分散性指数,用于描述聚合物分子量分布,在本研究中用来反映纳米Ag颗粒的粒度分布情况。可以看出,随着反应温度的提升,样品粒径呈现出先减小后增大的趋势。在反应温度为60℃时样品的粒径最小,且PDI值也最低。这表明纳米Ag颗粒在此条件下尺寸最小,且分布更为均一。因此60℃为制备AgNPs-CTS复合溶胶的最优温度,这与紫外—可见光谱的结果一致。对AgNPs-CTS复合溶胶的微观结构进行分析。进一步对纳米Ag颗粒进行TEM分析,发现制得的纳米Ag颗粒均呈近球形,粒径约为20 nm左右,大小相对均匀,并未发生团聚现象,这与之前的研究[24]结果一致。

采用平板培养法测定AgNPs-CTS复合溶胶对大肠杆菌和金黄素葡萄球菌的抑菌效果,以抑菌圈大小作为衡量指标,其中左侧为空白对照,右侧为复合溶胶。如图2所示,复合溶胶对两种菌都起到了明显的抑制作用,其中大肠杆菌的抑菌圈大小约为2.3 cm,金黄色葡萄球菌的抑菌圈大小约为2.5 cm,而空白对照则并未有明显抑菌圈出现。

图2 AgNPs-CTS复合溶胶的抑菌圈

2.2 AgNPs/Cu-CTS复合颗粒的制备和表征

抑菌材料在机洗过程中需要承受水流的冲击和机器运转产生的摩擦,因此不能直接以溶胶状进行应用。本研究进一步以上述制备的AgNPs-CTS复合溶胶为基础,制备了AgNPs/Cu-CTS复合颗粒。利用颗粒强度测定仪对制备好的抑菌颗粒进行检测,测定其机械强度为554.1±17.9 N,达到相关强度要求。进一步对AgNPs/Cu-CTS复合颗粒的表面和截面进行了扫描电镜分析,结果如图3所示。可以看出,复合颗粒的内部和表面均呈现出孔状结构,这可能与致孔剂邻苯二甲酸二丁酯的加入有关。此外,本研究中复合颗粒的多孔结构可为被吸附物Ag、Cu提供更多的吸附位点。同时,较高总表面积和多孔结构可能更有利于复合颗粒对细菌的杀灭。

图3 AgNPs/Cu-CTS复合颗粒的SEM图

采用平板培养法测定AgNPs/Cu-CTS复合颗粒对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果,以抑菌圈大小作为衡量指标。如图4所示,复合颗粒对两种菌都起到了明显的抑制作用,其中大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的抑菌圈半径均为0.5 cm。与复合溶胶相比颗粒材料抑菌圈大小有所减弱,但颗粒形态的复合材料能更好的应用在机洗程序中,且能更好的保持长效抑菌的效果。

图4 AgNPs/Cu-CTS复合颗粒的抑菌圈

2.3 AgNPs/Cu-CTS复合颗粒的机洗应用损耗测试

抑菌颗粒长期置于洗衣机内部使用,其寿命参数也十分关键。损耗测试结果如表1所示,随着洗涤次数的增多,抑菌颗粒在平板上的抑菌圈大小有所减弱,但其减弱并不明显。未经洗涤的抑菌材料其抑菌圈大小在0.50 cm,当进行50次时后抑菌圈大小仍有0.40 cm。壳聚糖能够通过离子交换、螯合等机制吸附金属离子[25],金属离子与壳聚糖通过氨基和羟基发生相互作用。这可能对抑菌颗粒在长期洗涤损耗的抑菌效果中起到了正向作用。

表1 抑菌颗粒机洗损耗

对复合颗粒机洗的抑菌效果进行了测试,结果如表2所示。结果表明,抑菌颗粒对菌布上的细菌有着较强的杀灭作用,且洗涤条件改变后抑菌效果达到了99.15%。这可能是因为AgNps、Cu+和CTS在洗涤环境中对菌体的作用使得很大一部分细菌被杀灭,同时改变后的环境更不利于菌体的存在。本复合材料在应用中具有较优的效果。

表2 复合颗粒机洗抑菌率

3 结论

本研究制备了AgNPs-CTS复合溶胶,对溶胶性能进行了表征,证明复合溶胶具有良好的抗菌性能。进一步的制备得到了AgNPs/Cu-CTS复合颗粒,对其形态、抑菌效果和在机洗中的应用进行了研究。AgNPs/Cu-CTS复合颗粒是一种具有多孔结构和长效抑菌性的复合抗菌材料。此材料在机洗过程中取得了较好的抑菌效果。