生物转化对罗汉果提取物挥发性成分的影响

魏 敏 宋旭艳 - 李 冉 肜 霖 董爱君 - 潘 曦

(湖北中烟工业有限责任公司，湖北 武汉 430040)

罗汉果(Siraitiagrosvenorii)是葫芦科苦瓜属植物的果实。黄世杰等[1]分析了罗汉果浸膏的香味成分，主要有糠醛、糠醇、5-甲基糠醛、2,4-二羟基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃-3-酮、5-羟甲基糠醛和反式角鲨烯等。研究表明，酶促反应[2]或者微生物发酵[3-6]可以改善天然香料质量，而且反应条件温和、专一性强、对环境友好[7]。陈义坤等[8]利用食甲醇芽孢杆菌生物转化山楂提取物，减少了其刺激性成分，提高了香气质；罗诚浩等[9]研究食甲醇芽孢杆菌生物转化当归提取物，新生成了丁酸、浓馥香兰素、香兰素、高香草醇等28种挥发性物质，其香气更丰富柔和；食甲醇芽孢杆菌还具有生物转化阿魏酸转化生产香兰素的功能[10]。近年来，以丁香酚、异丁香酚和阿魏酸为底物的细菌、真菌生产香兰素的研究逐渐变为研究热点[11]。

从香荚兰植株栽培土壤中筛选的产香菌——植生拉乌尔菌(RaoultellaplanticolaVP4-4)[12]，该菌株具有转化阿魏酸生成天然香兰素的功能和丰富的酶体系，能利用罗汉果提取物中的阿魏酸[13]、多糖、蛋白质等进行生物转化，生成香味物质或香味前体物。试验拟探究产香菌VP4-4生物转化对罗汉果提取物挥发性成分的影响，以期为罗汉果增香提质及开发利用方面提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

植生拉乌尔菌(RaoultellaplanticolaVP4-4)：CCTCC NO: M 2012005 2012.01.11，该菌从海南香荚兰植株栽培土壤中分离得到，武汉大学中国典型培养物保藏中心；

麦芽汁、葡萄糖、琼脂、麦芽糖、蛋白胨：BR级，北京三药科技开发公司；

二氯甲烷、无水硫酸钠、95%乙醇、盐酸、氯化钠：AR级，国药集团化学试剂有限公司；

斜面培养基：麦芽汁125 mL，葡萄糖20 g/L，琼脂15 g/L；

原始种子培养基：麦芽糖50 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠5 g/L；

罗汉果果实：产地为神农架。

1.1.2 仪器与设备

生化培养箱：SHP-080型，上海精宏试验设备有限公司；

灭菌锅：YX.350Z型，上海三申医疗器械有限公司；

超净工作台：SW-CJ-1FD型，苏净集团安泰公司；

数显电热恒温干燥箱：DM101 A-1型，武汉鼎立烘箱炉业有限公司；

旋转蒸发器：RE-5IAA型，上海亚荣生化仪器厂；

循环式真空泵：SHZ-D型，巩义市予华仪器有限公司；

电热套：TWCL-T型，巩义市予华仪器有限公司；

恒温摇床：HQL 300B型，武汉中科科仪技术发展有限责任公司；

pH计：DELTA-320型，瑞士Mettler Toledo公司；

密度折光仪：DMA4500型，奥地利安东帕有限公司；

电子天平：ALC-210.2型，德国Sartorius公司；

气相色谱质谱联用仪：TRACE GC Ultra-DSQⅡ型，美国Thermo Fisher公司。

1.2 试验方法

1.2.1 罗汉果发酵物及其提取物对照的制备

(1) 罗汉果发酵物的制备：用接种环挑取一环植生拉乌尔菌(RaoultellaplanticolaVP4-4)到装有200 mL液体种子培养基的500 mL三角锥瓶中，35 ℃，120 r/min培养3 d，然后接种到斜面培养基(麦芽汁、葡萄糖、琼脂)上，在恒温培养箱中35 ℃静置培养3 d，挑取一块斜面菌种，接种到60 mL原始种子培养基(麦芽糖、蛋白胨、氯化钠培养基)上，在35 ℃，转速120 r/min条件下振荡培养2 d，制得VP4-4种子培养液。

将罗汉果果实粉碎至40目粉末，取50 g粉末装入圆底烧瓶中，加入25倍质量水混合均匀，装上冷凝管，电热套加热，冷凝回流提取5 h，抽滤，取滤液，115 ℃灭菌20 min，得到罗汉果提取液，作为发酵底物。将VP4-4种子培养液与罗汉果提取液按V种子培养液∶V提取液=1∶5接种，混合均匀，取混合液350 mL置于1 L三角锥瓶中，用0.01 mol/L的HCl溶液调整培养液pH为6.5，恒温摇床设置温度35 ℃、转速120 r/min，发酵72 h，抽滤浓缩得到浸膏，加入3倍质量的体积分数95%乙醇进行醇沉，静置过夜后抽滤，将滤液减压浓缩，制得黄褐色浸膏，其相对密度为1.23，为植生拉乌尔菌发酵制备的罗汉果发酵物。

(2) 罗汉果提取物对照的制备：将罗汉果果实粉碎至40目粉末，取50 g装入圆底烧瓶中并加入25倍质量水混合均匀，装上冷凝管，电热套加热，冷凝回流提取5 h，抽滤，将滤液抽滤浓缩为浸膏，然后加入3倍质量的体积分数95%乙醇进行醇沉，静置过夜、抽滤，将滤液减压浓缩得到黄褐色浸膏，其相对密度为1.21，为罗汉果提取物对照。

1.2.2 挥发性成分分析

(1) 同时蒸馏萃取预处理：将植生拉乌尔菌VP4-4发酵的罗汉果发酵物和罗汉果提取物对照分别取5.0 g，装入1 L圆底烧瓶中，加入400 mL水，用电热套加热至沸腾，另一侧的圆底烧瓶中加入200 mL的二氯甲烷，60 ℃水浴沸腾，待中间分液管处液面出现分层后计时萃取5 h。萃取结束后，向二氯甲烷萃取液中加入无水硫酸钠，过夜，过滤并减压浓缩至1 mL，浓缩液用于进行GC-MS分析。

(2) 挥发性成分GC-MS分析：HP-5MS(50 m×0.25 mm×0.25 μm)毛细管柱；进样温度250 ℃；分流比20∶1；载气为He，流速1 mL/min；升温程序：从50 ℃(1 min)以5 ℃/min升到250 ℃(5 min)；传输线温度250 ℃；EI离子源；电子能量70 eV；扫描范围为50～400 amu；使用WILEY和MINILAB谱库进行检索，采用峰面积归一化的方法分析，计算每一挥发性组分在产物中的相对百分比含量。

2 结果与分析

2.1 挥发性化学组分分析

GC-MS总离子流谱图见图1。经GC-MS分析，通过WILEY和MINILAB谱库检索，罗汉果发酵物及其提取物对照共分离鉴定出89种挥发性化学组分，结果见表1。

图1 罗汉果发酵物和提取物GC-MS总离子流图Figure 1 Total ion chromatogram of Siraitia grosvenorii fermentation and extract by GC-MS

表1 罗汉果发酵物及其对照的挥发性成分及含量†Table 1 Volatile components and contents of Siraitia grosvenorii fermentation and its control

续表1

续表1

由表2可知，罗汉果提取物的挥发性化学成分主要为酸类、酯类、羰基类、烷烃类、 醇类和酚类，相对含量分别为41.20%(6种)，38.07%(15种)，6.15%(13种)，2.81%(1种)，1.14%(5种)，0.54%(2种)。经产香菌植生拉乌尔菌VP4-4生物转化后的罗汉果发酵物的挥发性化学组分，主要为酸类、酯类、羰基类、烷烃类、醇类和酚类，相对含量分别为60.07%(11种)，30.72%(14种)，4.07%(21种)，0.81%(5种)，0.34%(4种)，0.29%(2种)。与生物转化前相比，罗汉果发酵物的酸类物质相对含量大幅增加，酯类、羰基类、烷烃类、醇类、酚类相对含量减少。

2.2 挥发性成分种类分析

2.2.1 酸类物质 罗汉果发酵物挥发性成分中，酸类物质含量占比最高，是罗汉果发酵物主要香气成分或香味前体，对其风味有重要贡献。经VP4-4生物转化后的罗汉果发酵物挥发性成分中酸类物质相对含量和种类变化较大，由6种增加到11种，相对含量由41.20%提高至60.07%。选取对罗汉果发酵物中几种相对含量较高、对风味影响较大的挥发性成分进行详细分析：棕榈酸(18.20%)、岩芹酸(17.04%)、十七烷酸(0.21%)，相对含量分别提高至19.67%，22.33%，0.30%；新增的挥发性成分有亚油酸(16.17%)、2-甲基丁酸(0.06%)、己酸(0.16%)和棕榈油酸(0.76%)；相对含量降低的有肉豆蔻酸(从0.51%降至0.28%)和油酸(从0.83%降至0.21%)。有机酸在卷烟的加香加料过程中添加用以改善卷烟制品的吸味品质[14]，长链脂肪酸如棕榈酸、十七烷酸、亚油酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈油酸等具有调节烟草酸碱度，增加烟气浓度、甜味、蜡味和丰满度的功效，并间接影响烟草香气，在烟气中起到平衡作用[15-16]；2-甲基丁酸可以增进水果、酒香和乳脂香味，添加到卷烟中使烟气柔和滋润，改善辛辣刺激[17]；己酸具有奶酪香气[18]。

表2 罗汉果发酵物及其对照挥发性成分比例及种类数量

2.2.2 酯类物质 罗汉果发酵物挥发性成分中酯类物质共有14种，新产生了4种，消失了5种，6种含量减少，4种含量变化不明显。邻苯二甲酸二异丁酯(从8.15%降至5.33%)和邻苯二甲酸二丁酯(从22.93%降至19.79%)作为大分子刺激性物质相对含量减少，油酸乙酯(从4.59%降至2.50%)具有花香和果香[19]，亚油酸乙酯(从2.57%降至0.44%)具有降低血液中胆固醇和血脂的作用[20]，棕榈酸乙酯(从4.86%降至0.40%)呈蜂蜡香、果香[21]，柠檬酸三丁酯(0.13%)有果香味，硬脂酸乙酯(0.09%)可增加卷烟烟气的甜度，使烟香纯正丰满[22]。酯类物质是由酸和醇在相关酶的催化下经过酯化反应生成的，主要呈果香和花香，对整个罗汉果发酵物香气的结构和特点产生重要影响。

2.2.3 羰基类物质 罗汉果发酵物挥发性成分中羰基类物质由13种变为21种，总相对含量由6.15%减少至4.07%。主要羰基类香气成分中4-羟基-4-甲基-2-戊酮(二丙酮醇，从2.81%降至0.85%)有愉快香气，可能来自于加热浓缩过程中的美拉德反应[23]，苯乙醛(从0.16%降至0.74%)呈花香、玫瑰花香和蜂蜜香[24]，新产生的香气成分为5-甲基糠醛(0.14%)，具有持久的焦糖和水果香味，可使香气丰满、柔和、清润、协调、绵长[25]，苯甲醛(0.10%)有苦杏仁味[25]，壬醛(0.07%)具有柑橘香气[26]，4-羟基-3-甲氧基-苯甲醛(香兰素0.10%)具有香草及浓郁的奶香[27]，罗汉果原料中含有丰富的阿魏酸，经VP4-4生物转化阿魏酸产生香兰素。这些酮类、醛类物质对其整体香气起到了丰富花香、果甜香及奶香作用。

2.2.4 烷烃类、醇类和酚类物质 烷烃类、醇类和酚类物质相对含量在罗汉果发酵物挥发性成分中占比为1.44%，种类由8种增加为11种，其中糠醇(从0.18%降至0.09%)具有花香味[28]，同时醇类物质也是酯类物质的前体物；新产生的对乙烯基愈疮木酚(0.08%)具有辛香、木香[29]，在发酵过程中阿魏酸发生非酶脱羧反应得到，也是加热氧化生成香草醛的前体物[30]。这些物质相对含量较低，但也为罗汉果发酵物提供了花香及香味前体物等修饰作用。

3 结论

通过产香兰素菌株植生拉乌尔菌RaoultellaplanticolaVP4-4菌株转化阿魏酸生成天然香兰素的功能和丰富的酶体系，对罗汉果提取物中的阿魏酸、多糖、蛋白质等进行生物转化、酯化反应、结合加热过程中的美拉德增香反应，生成香味物质或香味前体物，通过同时蒸馏萃取和GC-MS技术进行分离鉴定，研究产香菌生物转化前后挥发性成分的变化。结果表明：经产香菌VP4-4生物转化后，罗汉果发酵物挥发性成分中化合物种类增多，由罗汉果提取物的50种增加为罗汉果发酵物的64种，其中新产生的挥发性成分有39种，酸类物质含量大幅增加，酯类种类和占比含量稍减少，羰基类、烷烃类的化合物种类增多，占比含量减少；主要香气成分或香气前体物为棕榈酸、岩芹酸、亚麻酸、2-甲基丁酸、己酸、油酸乙酯、棕榈酸乙酯、柠檬酸三丁酯、硬脂酸乙酯、4-羟基-4-甲基-2-戊酮、苯乙醛、5-甲基糠醛、苯甲醛、壬醛、糠醇、对乙烯基愈疮木酚香兰素等，这些挥发性组分协同作用，赋予了罗汉果发酵物花香、果甜香、奶香等丰富的天然香气，减少了大分子刺激性成分的种类和相对含量，起到了增香减杂的作用，对罗汉果的生物产香和生物香料利用开发有一定的指导作用。但发酵香气成分变化的机理仍需进一步研究。