副干酪乳杆菌HCS17-040的筛选鉴定及其益生特性

余 萍 曹 蓝 矫艳平 - 赵 迪 闵祥博 -

(江西仁仁健康产业有限公司，江西 樟树 331200)

医学上，将人体一种或多种血液脂类水平异常升高称为高脂血症，主要包括高胆固醇血症、高甘油三酯血症和高低密度脂蛋白血症[1]。近年来，由于生活不良习惯和饮食结构的改变，人们对高脂肪和高胆固醇食物的摄入增加，高脂血症的人群越来越多。目前高脂血症人群主要通过服用药物、加强运动量和调整饮食结构的方式加以控制，但长期食用药物对人体产生一定的副作用及运动不便等原因，部分人群的效果并不尽人意[2]。

益生菌是一类摄入后能够以活菌状态到达肠道，通过改善寄主微生态平衡，发挥益生作用的微生物[3-5]。益生菌具有的益生功能主要有维持肠道内正常菌群、抗感染、抗氧化、增强免疫力、抑制癌细胞、辅助降低胆固醇、促进人体对营养物质的吸收等[6-8]。近年来国内外研究者[9-12]发现乳杆菌、双歧杆菌等益生菌具有降胆固醇和降甘油三酯的功能，但未见关于副干酪乳杆菌降甘油三酯的研究。研究拟从母乳及顺产的健康婴儿粪便中分离筛选具有降甘油三酯功能的副干酪乳杆菌，并对其益生特性进行研究，以期为实现相关新型药物、保健食品的应用制备提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品

筛菌样品为顺产且母乳喂养的健康婴儿粪便样品3份、母乳样品2份，无菌操作取样寄送至实验室，并于-20 ℃条件保存备用。

1.1.2 培养基

MRS培养基[13]：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，磷酸氢二钾2 g，柠檬酸氢二铵2 g，乙酸钠5 g，葡萄糖20 g，吐温80 1 mL，七水合硫酸镁 0.58 g，四水硫酸锰 0.25 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.2～6.4，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

甘油三酯培养基[14]：将2%的聚乙烯醇水溶液与植物油按体积比3∶1混合，用超声波处理(控制参数每次超声5 s，间隔时间5 s，共超声70次)后混合均匀制成植物油乳化液，作为甘油三酯的来源。将植物油乳化液按5%的比例加入到MRS培养基中，调pH值至6.5±0.2，115 ℃高压蒸汽灭菌30 min。

改良MRS固体培养基：蛋白胨10 g/L，牛肉粉3 g/L，酵母粉4 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，柠檬酸2 g/L，乙酸钠5 g/L，葡萄糖20 g/L，七水合硫酸镁0.58 g/L，四水合硫酸锰0.25 g/L，吐温80 0.6 g/L，碳酸钙10 g/L，中性红0.05 g，番茄汁10 mL/L，琼脂粉20 g/L，调pH至5.5；115 ℃高压蒸汽灭菌30 min。

1.1.3 主要试剂及仪器

甘油三酯试剂盒：A110-1-1，南京建成生物试剂公司；

牛胆盐：TLC Sigma，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；

PBS缓冲溶液：20X，生工生物工程(上海)股份有限公司；

无水乙醇：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

冰乙酸、浓硫酸：分析纯，中国医药集团有限公司；

硫代乙醇酸钠(巯基乙酸钠)：分析纯，上海麦克林生化科技有限公司；

氢氧化钾：分析纯，天津市瑞金特化学品有限公司；

正己烷：分析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司；

双人单面净化工作台：SW-CJ-2D型，苏州净化设备有限公司；

电热恒温培养箱：DHP-500BS型，北京市永光明医疗仪器厂；

立式压力蒸汽灭菌器：LDZX-50KBS型，上海申安医疗器械厂；

生物显微镜：XSP-10CA型，上海佑科仪器仪表有限公司；

电热恒温水浴锅：DZKW-S-8型，北京市永光明医疗仪器有限公司；

超声波细胞粉碎机：SCIENTZ-ⅡD型，宁波新芝生物科技有限公司；

酶标仪：Multiskan FC型，美国赛默飞世尔科技有限公司；

低温高速离心机：TGL-16M型，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；

厌氧工作站：LAI-3DT型，上海龙跃仪器设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分离纯化 取500 μL样品加入到4.5 mL MRS(pH至5.5)液体培养基中稀释，混匀后再取500 μL加入到4.5 mL MRS(pH至5.5)液体培养基中稀释，以10倍稀释法稀释至10-6，取10-3～10-6稀释度分别取50 μL稀释液涂布到改良MRS固体培养基平板上，每个梯度两次平行，将平板置于37 ℃恒温培养箱中培养24～48 h。

挑取具有目的菌株典型特征(观察形态、大小、色泽、及其透明度等)、菌落较大、活性较强的单菌落，于改良MRS固体培养基平板上进行划线纯化培养，37 ℃培养24～48 h，如此反复2～3次，直到划线平皿中菌落特征一致；将纯化菌株进行革兰氏染色，显微镜观察及过氧化氢试验，将革兰氏染色阳性及过氧化氢酶阴性的菌株定为疑似乳酸菌，将纯化后菌株接种于MRS斜面培养基上培养，4 ℃保存备用。

1.2.2 降甘油三酯功能性测定

(1) 试验菌株的制备：将1.2.1中分离纯化的菌株划线分离出单菌落，挑取单菌落接种于5 mL MRS液体培养基中，37 ℃培养20 h后，再次转接至100 mL MRS液体培养基中，37 ℃培养17 h，然后以3%接种量接种于100 mL甘油三酯培养基中，37 ℃培养24 h。同时将未接种菌液的甘油三酯培养基37 ℃培养24 h。

(2) 甘油三酯含量测定：单试剂法(GPO-PAP法)。将甘油三酯培养基和经甘油三酯培养基培养后的菌液分别取10 mL用冷冻离心机于4 ℃，4 000 r/min离心10 min取上清液，按甘油三酯试剂盒说明测定。按式(1)计算甘油三酯(TG)含量。

(1)

式中：

CTG——甘油三酯含量，mmol/L；

A0——空白吸光度值；

A1——样品吸光度值；

A2——校准吸光度值；

M——校准品浓度，mmol/L。

(3) 甘油三酯下降率的计算：

(2)

式中：

RTG——甘油三酯下降率，%；

CTG1——总甘油三酯含量，即未接种菌液的甘油三酯培养基中甘油三酯含量，mmol/L；

CTG2——残留甘油三酯含量，即接种于甘油三酯培养基培养后的菌液中甘油三酯含量，mmol/L。

1.2.3 降甘油三酯功能菌株的鉴定

(1) 形态学特征鉴定：将菌株HCS17-040接种至MRS琼脂培养基37 ℃培养48 h，观察菌株形态。并挑取单个菌落进行革兰氏染色，在生物显微镜下观察菌体形态。

(2) 生理生化及16S rDNA鉴定：菌种生理生化特征鉴定及16S rDNA鉴定委托中国科学院微生物研究所完成。

1.2.4 耐酸性试验 用1 mol/L盐酸将MRS培养基pH值调至2.0或3.0，115 ℃高压蒸汽灭菌30 min，冷却备用。以未经调整的MRS培养基(pH为6.2～6.4)为对照，将活化后的副干酪乳杆菌HCS17-040菌液以体积分数10%的接种量分别接种于MRS对照培养基、pH 3.0和pH 2.0的MRS培养基中。37 ℃恒温静置培养17 h后取样，用灭菌的生理盐水进行10倍系列稀释，分别取适宜稀释度的菌液1 000 μL移入无菌空平皿中，将冷却至48 ℃ 的MRS琼脂培养基倾注入平皿约15 mL，转动平皿使其混合均匀。每个稀释度2次重复，37 ℃静置培养36～48 h后计数。按式(3)计算耐酸试验存活率。

(3)

式中：

S——受试菌株存活率，%；

N1——试验组培养基测得的活菌数，CFU/mL；

N0——空白对照组测得的活菌数，CFU/mL。

1.2.5 耐胆盐试验 在MRS培养基中加入牛胆盐，配置成胆盐质量浓度分别为3 g/L和5 g/L的MRS培养基，115 ℃高压蒸汽灭菌30 min，冷却备用。以不添加牛胆盐的MRS培养基为对照，将活化后的副干酪乳杆菌HCS17-040菌液按照体积分数10%的接种量分别接种于上述培养基中，37 ℃恒温静置培养17 h后取样，用灭菌的生理盐水进行系列10倍稀释，分别取适宜稀释度的菌液1 000 μL移入无菌空平皿中，将冷却至48 ℃的MRS琼脂培养基倾注入平皿约15 mL，转动平皿使其混合均匀。每个稀释度2次重复，37 ℃静置培养36～48 h后计数。按式(3)计算耐胆盐试验菌株存活率。

1.2.6 模拟胃液试验 配制人工胃液：取稀盐酸16.4 mL，加蒸馏水800 mL；加入胃蛋白酶10 g(1 g/100 mL)，摇匀后用蒸馏水稀释至1 000 mL，调节pH值至2.0，0.22 μm有机滤膜过滤除菌。

取活化后的副干酪乳杆菌HCS17-040菌悬液10 mL进行离心(5 000×g，10 min，5 ℃)，将获得的菌泥用PBS缓冲液冲洗2次后重悬于10 mL人工胃液中，37 ℃消化3 h，并分别于0，3 h取样测活菌数。按式(3)计算模拟胃液试验菌株存活率。

1.2.7 模拟肠液试验 配制人工肠液：用0.1 mol/L的氢氧化钠溶液将PBS缓冲液pH调节至8.0后灭菌，再加入1.0 g/L的胰蛋白酶使其溶解，0.22 μm有机滤膜过滤除菌。

取活化后的副干酪乳杆菌HCS17-040菌悬液10 mL进行离心(5 000×g，10 min，5 ℃)，将获得的菌泥用PBS缓冲液冲洗2次后重悬于10 mL人工肠液中，37 ℃下培养，并分别于0，2，4 h取样测活菌数。按式(3)计算模拟肠液试验菌株存活率。

1.2.8 数据处理 每个试验重复3次，采用SPSS 19.0软件和Excel软件进行数据分析，当P<0.05时，差异被认为是有意义的，结果表示为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 菌株降甘油三酯能力筛选

从婴儿粪便及母乳样品中共筛选分离出6株具有降甘油三酯功能的菌株，见表1。6株菌均为革兰氏染色阳性，过氧化氢酶阴性，球状或杆状，初步判断为乳酸菌。其中菌株HCS17-040的甘油三酯下降率最高，达到(42.80±1.79)%，其可能是通过吸收或吸附的方式将甘油三酯利用[15]。故选择菌株HCS17-040进行菌种鉴定及益生作用研究。

表1 菌株筛选结果

2.2 降甘油三酯功能菌株的鉴定

2.2.1 菌株的形态学鉴定 将菌株HCS17-040接种至MRS琼脂培养基37 ℃培养48 h后观察菌株形态，结果见图1。单菌落直径约1～2 mm，圆形凸起，颜色呈白色，菌落表面光滑细密。挑取单个菌落进行革兰氏染色并在生物显微镜下观察菌体形态，结果如图2所示，革兰氏染色阳性，细长杆状，长宽比大约为1∶3～2∶3，长短不均一，成单或成对、成链排列。

2.2.2 生理生化及16S rDNA鉴定 菌株HCS17-040生理生化鉴定结果如表2所示，根据菌种的细胞形态、生理生化特征、16S rDNA基因序列、pheS基因序列等试验数据综合分析，参考《伯杰氏系统细菌学手册》，并通过在美国生物工程信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)查阅国际相关的基因库，将副干酪乳杆菌CGMCC No 19747的16S rDNA序列与GenBank提交菌株序列相似性比较(见表3)，鉴定菌种HCS17-040为副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)。

2.3 耐酸性试验

益生菌进入人体后主要在肠道内发挥有益作用，因此必须具有较强的耐受胃酸能力，才能以较高的存活性通过胃环境。人体在空腹时胃液pH为2.0以下，进食后pH能达到3.0左右[16-17]。因此试验选定pH 3.0和pH 2.0进行检验菌株HCS17-040的耐酸性能力。结果见表4，副干酪乳杆菌HCS17-040菌株经过pH 3.0和pH 2.0环境下37 ℃培养17 h，活菌数虽有所下降，但都在108CFU/mL以上，能够满足益生菌在人体内发挥作用的浓度要求(106以上)[18]。菌株存活率分别可达到89.39%和87.18%，耐酸能力可能与该菌株双组分信号的调节及酸环境下细胞膜组成变化、蛋白质和DNA的损伤修复等耐酸机制有关[19]，该菌株具有良好的耐受酸环境的能力。

图1 菌株HCS17-040的菌落形态Figure 1 Colony morphology of strain HCS17-040

图2 菌株HCS17-040的菌体形态Figure 2 Morphology of strain HCS17-040 (16×100)

表2 菌株HCS17-040生理生化试验结果

表3 菌株HCS17-040的16S rDNA序列同源性分析

表4 副干酪乳杆菌HCS17-040耐酸性试验结果

2.4 耐胆盐试验

益生菌能够在肠道内保持存活性，较强的胆汁耐受能力是先决条件。人体肠道胆盐质量浓度通常维持在0.3～3.0 g/L[20]，因此试验选用3 g/L和5 g/L的胆盐质量浓度考察菌株的耐胆盐能力。如表5所示，副干酪乳杆菌HCS17-040在5 g/L的胆盐质量浓度环境中培养17 h存活率仍为92.97%，具有较强的耐胆盐能力，可能是由于该菌株在生长繁殖过程中产生胆盐水解酶来降低胆盐对自身细胞的危害或其表层蛋白对细胞的保护作用等[21-22]。

2.5 模拟胃液试验

益生菌进入人体内经过胃环境时，胃蛋白酶原能在胃液的酸性环境下激活杀死进入胃内的菌体，因此，益生菌不仅需要具有耐酸的能力，还需要能够耐受胃蛋白酶的能力才能存活[23]。将菌株HCS17-040置于人工胃液中作用3 h，结果见表6，经过人工胃液作用后活菌数仍在108CFU/mL以上，存活率达到93.93%，说明其具有较强的耐受胃液的能力，可以较高的活性通过胃环境进入肠道，发挥益生作用。

表5 副干酪乳杆菌HCS17-040耐胆盐试验结果

2.6 模拟肠液试验

肠液中除了含有大量的水分外，还有各种酶、胆汁酸等多种成分，对肠道内的菌群具有多方面的影响[24]。益生菌耐受肠液的能力也是评价其进入肠道后是否能够保持存活的重要指标。如表7所示，副干酪乳杆菌HCS17-040菌泥在人工肠液中37 ℃培养4 h后，菌株存活率为99.06%，说明该菌株对肠液具有很强的耐受能力。

3 结论

试验从母乳及顺产的健康婴儿粪便样品中分离筛选出6株具有去除甘油三酯能力的乳酸菌，并对其降甘油三酯的能力分别进行了测定，其中菌株HCS17-040的去除能力最强，下降率达(42.80±1.79)%。通过对其进行形态学鉴定、生理生化鉴定和16S rDNA鉴定确定菌株HCS17-040为副干酪乳杆菌。菌株HCS17-040的耐胃酸环境能力较强，在pH 3.0，2.0环境下37 ℃培养17 h后，存活率都能保持在87%以上，在人工胃液中作用3 h，存活率高达93.93%，说明该菌株能够以较高的存活性通过胃环境进入肠道。胆盐耐受及模拟肠液试验表明，菌株HCS17-040具有很强的耐受胆盐及肠液的能力，在3，5 g/L胆盐浓度环境中作用17 h，菌体存活率均在92%以上，在人工肠液中培养4 h存活率为99.06%，该菌株具有较强的耐胆盐及肠液的能力。但试验中副干酪乳杆菌HCS17-040的去除甘油三酯能力源于吸收、吸附，还是其他的方式有待进一步研究。

表6 副干酪乳杆菌HCS17-040模拟胃液试验结果

表7 副干酪乳杆菌HCS17-040模拟肠液试验结果