肿瘤标志物P16INK4A在器官纤维化治疗中的研究进展

施建伷，韦天文综述，刘加宝，王连生审校

0 引 言

P16INK4A蛋白是由ink4a基因编码的一种16 kDa的小分子蛋白，又被称之为细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子2A (cyclin-dependent kinase inhibitor 2A,CDKN2A)。在细胞周期调控中，P16INK4A蛋白通过P16INK4A/Rb通路竞争性下调CDK4和CDK6，影响下游蛋白磷酸化，使得E2F因子无法被激活，进而阻遏细胞从G1期进入S期[1-3]。DNA在遭受损伤后，细胞会暂时停止复制并启动DNA修复。如果损伤程度严重，细胞会永久性地退出细胞周期并进入程序性死亡，即称之为细胞衰老[4]。就真核细胞而言，细胞增殖调控主要发生在G1-S和G2-M这两个关键点，由于G1-S期在细胞周期调控中处于更加重要的位置，因此阻遏G1-S期即可推动细胞进入细胞衰老[1]。

衰老细胞和其他终末分化细胞不同在于其特征性的衰老标志物，一种常用的标记组合为衰老相关的β半乳糖苷酶(senescence associated β-galactosidase，SA-β-GAL)联合细胞周期抑制因子P16INK4A蛋白[5]。目前的理论认为，细胞衰老在肿瘤和纤维化的发生发展进程中有着重要的作用。作为细胞衰老的标志物之一，P16INK4A蛋白及其调控的相关因子与肿瘤和纤维化关系密切。目前热点领域正在进行P16INK4A蛋白作为治疗干预靶点的探索，本文就P16INK4A蛋白目前的主要研究进展作一综述。

1 P16INK4A蛋白作为肿瘤标志物的应用

P16INK4A蛋白的水平受细胞状态的影响具有高度动态性。在健康正常的组织中，P16INK4A蛋白处于低表达甚至不表达状态，并且表达量和年龄呈正相关[5]。P16INK4A蛋白通过P16INK4A/Rb通路对细胞周期调控参与细胞增殖和细胞衰老，由于Rb蛋白在恶性肿瘤中常处于失活状态，受P16INK4A/Rb通路负反馈调节影响，P16INK4A蛋白在恶性肿瘤中呈高表达，但此种由于自身负反馈调节引起的P16INK4A升高仅能作为肿瘤标志物为临床提供指示作用，并不能够对肿瘤细胞周期起到调控功能[6]。这种负反馈表达的特点使得研究者们将P16INK4A蛋白作为肿瘤标志物用于临床诊断和预后监测[7-8]，同时将其作为潜在的治疗靶点进行新型靶向药物的探索。细胞实验已证实在部分肿瘤模型中敲除ink4a基因导致肿瘤的快速恶化，而在肿瘤的癌前病变阶段，P16INK4A蛋白存在高表达现象。这一结论提示细胞衰老可在癌前病变阶段阻止肿瘤进一步恶变，某些关键的衰老标志物如P16INK4A蛋白可能在肿瘤的发展进程中起着预警和屏障作用[9]。

1.1人乳头瘤状病毒(human papilloma virus,HPV)相关癌症HPV可广泛感染人类皮肤黏膜，全球约5%的癌症是由高危型 HPV感染引起，包括几乎所有的宫颈癌、80%的肛门癌、65%的阴道癌、50%的外阴癌和35%的阴茎癌等。高危型HPV表达的E7蛋白可与Rb蛋白结合，同时抑制了对P16INK4A蛋白的负调节作用，导致P16INK4A蛋白表达升高。因此，在HPV感染相关的肿瘤中，P16INK4A蛋白被认为是HPV-DNA检测的替代性标志物[10,11]。

1.1.1宫颈癌高危型HPV感染已明确是宫颈癌的病因之一，已有研究验证了P16INK4A蛋白检测作为HPV替代物在宫颈癌诊断中的替代价值[10]。将P16INK4A蛋白和Ki-67两者结合，在宫颈癌和癌前病变的诊断中有更高的敏感性和特异性，在危险分层、诊断和治疗中有广阔的应用前景[12-13]。一项荟萃分析认为P16INK4A蛋白高表达和宫颈癌患者更好的预后相关[14]，进一步的研究发现尽管P16INK4A蛋白在宫颈癌中呈高表达，但主要定位于细胞质而非细胞核，因此如何促进胞质中的P16INK4A蛋白进入胞核发挥作用可能是宫颈癌潜在的治疗方向之一[15]。

1.1.2头颈部鳞状细胞癌头颈部鳞癌的经典高危因素主要包括吸烟和酗酒等不良生活习惯，近年来的研究发现，高危HPV感染导致的头颈部鳞癌的比例不断上升。有学者观察了头颈部鳞癌病理组织中P16INK4A蛋白和HPV病毒表达的相关性，结果提示在头颈部鳞癌样本中，通过组织免疫化学法检测的P16INK4A蛋白和通过PCR检测的HPV病毒表达高度相关[11]。

1.1.3肛门和生殖器肿瘤超过80%的肛门癌合并高危型HPV感染，高危型HPV感染的肛门组织免疫组化显示为弥漫性P16INK4A蛋白阳性，而低危型则为斑点状。Eva 等人进行的一项小规模回顾性研究表明，在肛门癌组织中，HPV感染和P16INK4A蛋白阳性有着高度一致性，同时P16INK4A蛋白检测阳性的患者预后显著优于阴性的患者[16]。最近的一项Meta分析得出了同样的结论，认为P16INK4A蛋白阳性的病人生存时间大约是阴性患者的3倍，同时联合进行HPV-DNA和P16INK4A蛋白检测对预后有积极影响[17]。

外阴癌是女性生殖道第四常见的恶性肿瘤，80%～90%的外阴癌为鳞状细胞癌，约1/5合并HPV感染。相关学者分析发现，P16INK4A蛋白过表达和HPV感染之间存在不匹配现象[18-19]，这种矛盾的结果可能和研究样本中P16INK4A蛋白阳性率相关。由于HPV的E6和E7蛋白分别作用于p53和Rb蛋白进而促使癌细胞进入无限增殖状态，因此p53和P16INK4A蛋白过表达均可作为外阴癌的独立预后因子[20]。更进一步的研究表明，外阴癌中P16INK4A蛋白过表达可能是更强的独立预后因子[21]。由于是否存在其他机制导致P16INK4A蛋白在HPV感染的细胞中过表达尚不明确，因此该结论需要在更大规模的人群中进行验证。

1.2非HPV相关肿瘤在包括淋巴瘤、皮肤和黑色素瘤、头颈部肿瘤、胰腺癌、肺癌、食管癌、消化系统肿瘤、卵巢癌、前列腺癌和肾癌等多种类型肿瘤中均检测出不同形式的P16INK4A基因突变(包括启动子甲基化、组蛋白缺失和纯合子缺失等)[22-24]，进一步导致了P16INK4A蛋白在不同起源的肿瘤和同一部位但不同组织学类型的肿瘤之间的意义不同[25-27]。除原发性肿瘤外，国外学者进一步探讨了P16INK4A蛋白在转移性肿瘤中的价值。通过对灌洗液进行免疫组化染色分析，研究者发现P16INK4A蛋白过表达在肿瘤诊断中的特异性高达96.96%，可作为补充的诊断标志物[28]。

2 P16INK4A作为治疗靶点在器官纤维化中的应用

早期的研究已经证实细胞周期抑制剂P53和P16INK4A和细胞衰老进程密切相关[29]。健康细胞或组织在遭受急慢性损伤后处于一种炎症反应状态，受损伤的细胞分泌多种细胞因子和趋化因子，募集包括中性粒细胞和巨噬细胞等在内的炎性细胞推动纤维化进程[30]。衰老细胞随着年龄增加而增加，最终超过机体清除能力在体内蓄积。衰老细胞虽然停止进入细胞周期，但是会产生衰老相关分泌表型(SASP)持续推动纤维化疾病进展[31]。

2.1肾纤维化Valentijn等[32]总结发现在多种肾脏疾病中均可观察到细胞衰老现象，其主要标志物包括了SA-β-Gal、P16INK4A和P21这三种组合。在INK4A基因敲除鼠中进行单侧输尿管结扎以诱导急性肾损伤模型，术后发现INK4A基因敲除鼠肾脏组织中胶原蛋白沉积增加约1.5倍，同时肾脏基质纤连蛋白沉积增加约2倍[33]。除直接干预P16INK4A基因表达会影响肾纤维化外，Baker等[34]进一步验证干预P16INK4A阳性的衰老细胞是否有相同的价值。在自然衰老的INK-ATTAC转基因小鼠中通过药物靶向敲除INK4A阳性细胞，结果发现清除INK4A阳性细胞可以显著延缓随年龄进展的肾小球硬化，保护了肾功能。这些研究均提示P16INK4A蛋白可能通过基因表达和衰老细胞分泌这两种途径影响肾纤维化，并且在调控上存在时空差异，为未来不同疾病模型的干预提供了新的手段。

2.2肺纤维化和肾纤维化类似，过表达P16INK4A基因和清除P16INK4A阳性细胞均可减轻肺纤维化。支气管发育不良是一种早产儿的慢性呼吸系统疾病，疾病终末期表现为不可逆的肺广泛纤维化。早期研究发现大鼠暴露于高氧环境后P16启动子甲基化水平会逐渐升高，这导致了P16的显著低表达并导致肺组织纤维化[35]。Zhao等[36]用DNA甲基化抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞嘧啶核苷上调了P16INK4A基因表达后小鼠肺纤维组织减少，肺羟脯氨酸水平显著下降，肺纤维化程度减轻。特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是各种弥漫性肺病的终末阶段，表现为肺间质重塑和肺功能受损[37]。最新的观点认为细胞衰老可能通过以下三种机制诱导IPF纤维化：①干细胞衰老削弱了肺组织修复和再生能力；②衰老的细胞通过SASP加速纤维化；③肺成纤维细胞通过细胞衰老逃逸细胞凋亡[38]。目前已证实在IPF患者的肺组织中Ⅱ型肺泡上皮细胞P16INK4A基因表达明显升高且和IPF严重程度呈正相关[39]。在博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中，和单纯博来霉素干预组相比，靶向清除INK4A阳性的细胞可以消除肺组织中的衰老细胞，削弱其旁分泌作用，延缓了21天内Mcp1，IL-6，Mmp12和TGF-β等SASP的增加，改善了肺功能[40]。

2.3心肌纤维化心肌纤维化是由心肌缺血、系统性疾病或药物等有害刺激作用于心脏导致的，是所有心脏疾病的最终转归，其特征主要包括心脏成纤维细胞的聚集和细胞外基质的沉积。在心肌梗死这类急性心脏疾病中，纤维瘢痕在早期替代坏死的心肌细胞有利于稳定心脏结构，防止心脏破裂。但是在心衰这一类慢性心脏疾病中，心肌纤维化逐渐增加导致心室壁硬化，严重影响心脏功能，增加死亡率[41-44]。

Meyer等[45]在P53和P16INK4A基因敲除鼠中构建横向主动脉狭窄(transverse aortic constriction，TAC)模型，和野生型小鼠相比，基因敲除鼠在TAC术后6周纤维化显著加重，心功能受损。这一结果初步揭示了P16INK4A蛋白可能在心脏纤维化调控中扮演重要的角色，但目前直接或间接干预P16INK4A蛋白对心脏纤维化影响的研究相对较少，需要未来进一步探索和发现其应用价值。

3 结语与展望

P16INK4A蛋白作为细胞周期抑制因子，从基因层面对其表达进行干预或靶向清除其阳性表达的细胞已经在不同疾病中展现出其生物学价值。靶向抑制CDK4/6的抗肿瘤药物Palbociclib，Ribociclib和Abemacilib在机制上模拟了P16INK4A蛋白对细胞周期的抑制作用，目前主要应用于乳腺癌治疗，未来有望推广到其他肿瘤的治疗中。同样地，过表达P16INK4A基因或清除衰老细胞可以有效缓解器官纤维化，这一结论为纤维化疾病的治疗提供了新的思路。

除了在肿瘤和器官纤维化领域的应用外，最新的研究发现肝脏部分切除术后，P16INK4A水平的降低会影响肝脏组织的再生[46]。这一结论初步揭示了P16INK4A蛋白在组织再生领域的潜在价值，为未来不可再生器官的治疗如神经修复和心肌再生提供了一定的理论基础。关于P16INK4A蛋白的功能目前仍在不断地探索中，希望未来有更多的研究对其价值进行更全面地挖掘。