类风湿关节炎病证结合动物模型研究进展

张新伟，阿热艾·阿达力，豆江移，杨可人，周晓涛，周文涛

(1. 新疆医科大学第三临床医学院，新疆 乌鲁木齐 830011；2. 新疆医科大学中医学院，新疆 乌鲁木齐 830011；3. 新疆医科大学，新疆 乌鲁木齐 830011；4. 新疆医科大学基础医学院，新疆 乌鲁木齐 830011；5. 新疆医科大学第五附属医院，新疆 乌鲁木齐 830011)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种常见自身自身免疫性疾病，病理特征是滑膜炎、软骨破坏，晚期导致关节畸形，目前仍无根治方法。RA的病因尚未完全阐明，但有相关文献表明，RA的发病与温度、湿度、空间、遗传、环境、肠道等因素密切相关[1-2]。RA相关动物实验模型的构建多为实验室标准情况下的发病，所以越来越多的学者尝试从病证结合动物模型进行制备，尤其中医的证型上，尽量使科研与临床现实情况更接近。现将当前病证结合动物模型的研究进展情况综述如下。

1 RA病证结合模型目前的动物选择

RA病证结合动物模型建立在RA模型的基础上。RA模型目前公认最佳的为胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型，由Trentham等[3]于1977年提出，该模型在许多方面与人类RA高度相似。佐剂型关节炎(AA)模型应用也较广泛，其起病急，有自愈性，可以模拟RA急性发病与缓解的病程特点[4]。卵清蛋白(OVA)诱导的关节炎较多应用在兔、羊等动物，其他RA模型如油诱导的关节炎、链球菌诱导的关节炎、蛋白多糖诱导的关节炎等，局限性较大或应用报道较少[5]。在这些基础上，学者尝试了多种动物来构建RA病证结合动物模型。

1.1兔子 在RA动物模型构建中，兔子因其性格温顺，体格较大，造模后关节症状更加容易观察，测量方便等优势，是关节类疾病造模常选用的动物品种。在RA病证结合模型中，李征等[6]将环瓜氨酸多肽(CCP)与完全弗氏佐剂(CFA)混合注入家兔后肢，建造RA血瘀痹阻模型。冯振宇等[7]在CIA模型基础上给予风寒湿刺激和葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B，SEB)外涂制备RA风寒湿痹动物模型。袁博等[8]采用卵蛋白联合冰冻低温建立寒证RA家兔模型。

1.2大鼠 鼠类也是目前动物造模中应用较多的动物品种。其中大鼠的选择类型多集中在SD大鼠、Wistar大鼠、Lewis大鼠。在CIA造模中，雌性Wistar大鼠的CIA造模成功率高于雄性；Lewis大鼠造模成功率高于Wistar大鼠；Wistar大鼠造模起病急，恢复快；Lewis大鼠造模起病慢，恢复慢[9-10]。金祝秋等[11]在病证结合动物模型的造模中选用雌性SD大鼠，将大鼠置于5～7℃的冷水中，持续20 min，伴风力刺激，每天1次，持续14 d，在造模第1天注射CFA 0.1mL于小鼠右后肢，造模成功率较高。

1.3小鼠 动物实验中，小鼠品种可以选择的有DBA/1小鼠、C57BL/6小鼠、balb/c小鼠等，目前RA病证结合模型多以大鼠为主，小鼠较少。小鼠在CIA模型、AA模型等选用较多,其中较为经典的是DBA/1小鼠CIA模型，造模成功率为90%～100%[12]。C57BL/6小鼠CIA造模成功率在50%左右，且差异较大，如四肢肿胀不一[13]。如要以小鼠建造RA病证结合模型，可以根据CIA、AA等模型的不同特点来选择造模，并施加外因。

2 RA湿关节炎病证结合动物模型研究进展

RA在中医属于“痹病”范畴，中医治疗思想以整体观念、辨证论治为主，辨证和辨病相辅相成。RA的模型如CIA模型、AA模型严格来说并不完全代表中医痹证的辨证分型，尤其是模型并不是人类疾病的完全复制。因此很多学者在RA动物造模阶段，通过给予各种外因刺激，模拟混杂因素建造RA病证结合模型，使模型同时具有疾病的特点和中医学的证型特点[15]。目前中医证型分型仍未完全统一，其中较为认可的是风寒湿痹型、风湿热痹型、虚证型、痰瘀痹阻型、血瘀痹阻型等。

2.1风寒湿痹病证结合动物模型 吕爱平等[15]将Wistar大鼠置于15 ℃冷水中游泳7 min，1次/d，持续7 d，然后取1.5 mg/mL的Ⅱ型胶原0.125 mL于小鼠尾部、踝部注射。结果显示前期滑膜充血水肿，有炎症细胞浸润；后期出现软骨损伤。该实验未设立单纯CIA大鼠组，未说明寒湿刺激单独的影响,实验结果为胶原诱导和寒湿刺激的综合结果。肖长虹等[16]改进了造模方法，自制风寒湿造模箱。实验设置单纯CIA组、风寒湿CIA组、CIA+SEB组、风寒湿CIA+SEB组。造模方法为每只Wistar大鼠注射Ⅱ型胶原500 μg，7 d后加强注射200 μg，造模组风速18 m/s，相对湿度100%，温度7～10 ℃，1次/h，共刺激9 d。该实验补充了吕爱平等[5]的实验不足，建立了单纯对照组。结果显示单纯风寒湿刺激降低了关节炎症程度，如附加SEB则能提高炎症程度和炎症因子水平。但陈欢等[17]的实验结果相反，结果显示寒湿刺激使炎细胞浸润增多，病理损伤加重，大鼠的足踝肿胀更严重。苏杉等[18]实验也说明风寒湿加重了炎症反应，同时大鼠血清类风湿因子(RF)、基质金属蛋白酶-3(MMP-3)水平及MMP-3 mRNA表达量均更高。袁博等[8]采取冰袋给兔关节降温至-20～-25 ℃模拟寒刺激，1.5 h后在45 ℃温水中复温5 min，并给予卵蛋白免疫，结果家兔出现萎靡不振，膝关节肿胀，局部青紫，皮温低，成功建成寒证模型。这种寒刺激只需给予1次。目前低温冰冻法应用的较少，可以联合风和湿的刺激来进行更多尝试。

2.2风湿热痹病证结合动物模型 申洪波[19]选SD大鼠，使用人工合成CCP多肽抗原与CFA混合注射大鼠足底，湿热刺激为湿度95%～100%，温度30～33 ℃，1次/d，共1 h，持续9 d。结果显示湿热CIA组RF、CCP抗体水平均显著上升，抗核周围因子(APF)、抗角蛋白抗体(AKA)阳性程度最高。该实验说明环境因素能使病情进展更严重。镇兰芳[20]选雌性Wistar大鼠，造模刺激为湿度(90±4)%，温度(33±2)℃，风力3级，4 h/d，持续30 d。结果显示造模组血沉(ESR)、白细胞介素(IL-17)、CD44、Fas、FasL、芳香烃受体(AHR)表达均增强，风寒湿对这些指标表达的影响比风湿热更严重。王蓉等[21-22]用SD大鼠造模，造模刺激为风速5 m/s，湿度≥95%，37 ℃蒸汽熏蒸，1次/d，共30 min，持续11 d，第12天进行Ⅱ型胶原免疫刺激。结果显示风湿热组MMP-1蛋白、MMP-1 mRNA、血管内皮生长因子(VEGF)表达量较单纯CIA组更高；基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP-1)、TIMP-1 mRNA表达量较单纯CIA组更低。

2.3脾虚痹病证结合动物模型 徐世杰等[23]选DBA小鼠，脾虚CIA组造模方法为大黄煎液每天25 mL/kg灌胃，第2周给予饥饱失常的刺激+Ⅱ型胶原。结果脾虚CIA组血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-6水平上升明显，与单纯CIA组差别明显；干扰素-γ(IFN-γ)也上升，与单纯CIA组差别不大；IL-10下降，较单纯CIA组下降更明显。杜中平等[24]用利血平的不良反应来模拟脾虚，脾虚CIA组造模方法为大鼠腹腔注射利血平0.5 mL/(kg·d)，14 d后给予牛Ⅱ型胶原诱导RA。结果脾虚CIA组大鼠精神萎靡，毛色无光，懒动，关节肿胀和病理损伤较单纯CIA组重；血清TNF-α、INF-γ、IL-10水平显著上升，IL-10水平较单纯CIA组更高，其余因子比较无明显差异。该实验IL-10水平升高和徐世杰等[23]实验结果不符。目前脾虚痹病证结合动物模型研究较少，方法有大量苦寒药物建立气虚模型[25]，利用利血平的不良反应导致胃肠功能紊乱，胆碱能神经兴奋模拟脾虚[26]。从胆碱能神经、副交感神经兴奋这个角度可以使用更多药物来进行尝试。

2.4肾虚痹病证结合动物模型 艾景录等[27]选DBA小鼠，造模方法：雌性小鼠行卵巢切除术+Ⅱ型胶原注射，给雄性小鼠乙烯雌酚灌胃+Ⅱ型胶原注射。病理显示卵巢切除组关节破坏更严重，炎性细胞浸润更多，去卵巢加重了CIA动物模型的病情；给予雌激素的雄鼠病情减轻。王燕等[28]用羟基脲375 mg/(kg·d)给SD大鼠灌胃，17 d后Ⅱ型胶原诱导，羟基脲CIA组关节损伤、肿胀较去卵巢CIA组更重。寿旗杨等[29]切除雄性Wistar大鼠肾上腺模拟肾阳虚，辅以佐剂诱导关节炎，结果提示肾阳虚促进RA的发展。陶黎等[30]采用切除SD雌鼠卵巢+Ⅱ型胶原诱导RA炎，结果显示去势增加RA中炎症因子表达，使关节破骨细胞数增多。

2.5痰瘀痹阻病证结合动物模型 许多RA患者存在血脂代谢紊乱，有研究表明在RA发病许多年前,总胆固醇、三酰甘油就有升高[31]。唐先平[32]用高脂饲料喂养Wistar大鼠，猪油灌胃。高脂饲料组AA大鼠出现食欲下降、大便稀、活动减少等症状，同时有RA的特点，如足踝肿胀、TNF-α等因子水平升高，即造模成功。陈哲等[33]选Wistar雌性大鼠，给予牛Ⅱ型胶原诱导炎症，饲养期间给予高脂饲料。结果显示高脂饲料组CIA大鼠关节肿胀程度及血清TNF-α、IL-1β、IL-17、TC、LDL-C水平明显上升，HDL-C水平明显下降，提示高血脂症，但与高脂饲料对比组差别不大。该实验说明高血脂症可加重RA的病情。

2.6血瘀痹阻病证结合动物模型 李征等[6]将CCP抗原和佐剂混合，注射于兔子双侧腘窝淋巴结内，2周后加强免疫。结果显示CCP佐剂组自身抗体水平更高，与佐剂组差异明显；凝血时间缩短，纤维蛋白肽A(FPA)和D-二聚体水平升高，与CCP组差异明显，提示体内可能存在高凝状态。CPP多肽和佐剂分别都能引起类似RA的反应，合用可能会加重病情。章平衡等[34]研究表明RA患者体内高凝状态与炎症因子、活动性指标密切相关，该结论与李征等[6]的实验结果相符合。李茜等[35]选SD大鼠，用Ⅱ型胶原诱导RA，诱导血瘀证的刺激为注射盐酸肾上腺素+冷水游泳。结果显示血瘀证CIA大鼠RF、血栓素A2(TXA2)、超敏C-反应蛋白(hs-CRP)及血液黏度增高，提示炎症发生和体内可能存在高凝状态。该实验未说明肾上腺素刺激和冷水刺激对单纯CIA大鼠的影响。

3 不足和展望

目前病证结合动物模型广泛在实验中运用，模型为中医药及其他药物的应用提供了许多思路，但仍有较大不足，主要有以下几方面。

3.1不能很好地模拟临床疾病的发病状态 目前公认的CIA模型虽然有许多与RA类似的因子和病理变化，但和临床RA疾病过程不完全相同，加上目前病证结合动物模型造模思路较为单一，仅仅将现代医学的“病”和中医的“证”进行“1+1”，即在RA模型基础上施加外因。某种角度上说，在中医里如风寒湿等因素为RA的病因，但是在病证结合动物模型中RA的发病基本是由各种胶原和抗原来诱导，单独给予风寒湿等因素并不能导致RA发病，所以目前病证结合动物模型不能很好地模拟临床发病。

3.2造模标准和模型评价标准不统一 目前可用于实验的动物模型较多，有不同品种小鼠、大鼠、兔子，刺激因素温度、风速、湿度不统一，测定的血清因子也不统一。如在不同的实验中选取了同一因子，但温度等条件不统一，不能很好地进行比较。同时各个实验选取测定的因子较少，很难发现不同类型病证结合动物模型的因子变化。当多种因素同时施加时，难以发现其中单个因素对RA模型造成的影响，如申洪波[19]采取刺激条件为湿热，镇兰芳[20]则为风湿热，结果提示两种刺激都加重了大鼠的病情。

综上，病证结合动物模型目前取得一定进展，但仍有较大发展空间，如血清测定细胞因子较少，难以进行比较时，使用基因芯片、蛋白质芯片技术[36]可以测定多种因子，在不同证型中进行比较。同时运用Meta分析可以一定程度解决造模条件不一致导致实验难以相互比较的问题。有Meta分析指出，在RA冷热证型中，人体内的细胞因子表达不同，信号传导通路可能不同[37]，这提示对不同类型的RA患者的特定靶点使用药物，可能会有更好的效果。从这个角度，研究者可以去寻找更多病证结合动物模型中不同的靶点。因此，病证结合动物模型需要进一步尝试和探索，争取能更贴近临床，服务于临床。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。