外泌体在非小细胞肺癌诊断及治疗中的作用

朱 鹏 张志明 雍文兴 王功臣 呼永华 宋忠阳 吴亚娜 苏 欢 杜婷婷

肺癌是全球发生率和病死率最高的恶性肿瘤之一，而非小细胞肺癌(non-small cell lunch cancer,NSCLC)发生率占据了肺癌的绝大多数[1]。Ⅰ期NSCLC患者术后5年生存率可达80%以上，但由于早期特异性诊断标志物缺乏等原因，NSCLC患者确诊之时往往已处于晚期，故NSCLC患者的5年生存率仅为5%左右[2]。因而迫切需要发现敏感度、准确率更高的早期诊断方法及治疗方法以提高NSCLC患者的生存率。近年来，基因组学和蛋白质组学迅猛发展，人们对外泌体有了更深入的研究，外泌体携带的多种生物分子活性成分参与细胞的迁移、通信与生长、血管的新生等生理和病理学过程[3]。因此，外泌体为NSCLC提供了新的研究途径，能够成为早期诊断和治疗的潜在生物学标志物[4]。

一、外泌体概述

1.外泌体的起源、结构、组成及分布：外泌体(exosomes)是由多种活性细胞分泌的具有脂质双层膜结构的纳米级囊泡，最早可追溯到1983年，是Johnstone等在研究网织红细胞成熟的过程中被发现并命名的[5]。质膜循环途径中的膜腔或早期胞内体是其产生的起源，而后向内凹陷形成管腔内膜泡并发展成多泡小体，在细胞内分子马达的牵引下，多泡小体与细胞表面融合，最终被分泌出去，此被称之为“内吞-融合-外排”调控过程[6]。外泌体形态规则，呈杯状或双凹蝶形，大小均匀，直径为30～100nm。外泌体其内含大量的生物活性物质如：①蛋白质：由在外泌体中普遍存在的膜转运和融合相关蛋白(Alix、Rab蛋白、TSG101、G蛋白等)、细胞骨架成分蛋白、整合素和四跨膜蛋白(CD81、CD63、CD9等)等固有蛋白及与细胞来源和组织类型相关的特异性蛋白两大类组成[7]；②核酸：包括长非编码RNA(lncRNA)、各种RNA亚型、双链DNA、微小RNA(microRNA或miRNA)等[8]；③脂质：包括磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、神经节苷脂、胆固醇、鞘磷脂、卵磷脂等[9]。无论在生理或病理条件下，一些细胞均可以胞吐的方式将外泌体释放入各种体液之中，包括尿液、血液、唾液、支气管肺泡灌洗液、母乳、精液、羊水、脑脊液、腹腔积液、胆汁等，通常采用差速离心法可得到外泌体[10]。

2.外泌体的生物学特性：经研究证明，外泌体在各种细胞的生理和病理过程中起着重要的作用，作为细胞外微环境的重要成分之一，归结起来，外泌体的生物学功能如下[11]：(1)细胞通讯与物质传递。首先，外泌体可参与细胞间信息传递及物质运输：外泌体不仅能够作为信号复合物通过受体介导直接刺激靶细胞，还可通过转运核酸、蛋白质、细胞器、膜受体等生物活性成分进入靶细胞内，从而影响靶细胞基因的转录和翻译并调节细胞信号通路，最终改变靶细胞的表型及功能状态。经研究发现，它在改变相邻细胞的生物学功能的同时还可对相距遥远细胞的功能产生重要影响。(2)促进血管与神经新生。外泌体可促进血管的生成进而促使伤口愈合，又可促进损伤神经的修复。(3)促进肿瘤细胞生长。(4)参与免疫应答与免疫调节。(5)介导抗原递呈等。

二、外泌体在NSCLC早期诊断中的作用

外泌体与其他生物学标志物比较有着明显的优势，其生物活性物质miRNA和蛋白质因受双层脂质保护可长期稳定存在于血清、血浆或其他体液之中而免受蛋白酶或RNA酶的降解。同时，在癌症患者体液中外泌体更容易被分离和分析，因此外泌体可能替代NSCLC传统的诊断方法应用于临床，成为在临床诊断中较理想的生物学标志物。

1.外泌体相关miRNA与NSCLC的诊断：miRNAs是一类含有20～25个核苷酸的非编码小RNA，可通过结合其靶mRNAs的3′ UTR来调节靶基因转录水平上的基因表达，从而导致靶基因表达的改变。通过对正常肺组织和NSCLC肺组织对比发现，NSCLC肺组织中miRNAs的表达量明显较高，目前miRNAs多被发现存在于NSCLC患者的外泌体中，参与NSCLC的形成及演化过程。因此，外泌体的miRNA具有成为NSCLC诊断标志物的潜质。Poroyko等[12]在NSCLC患者血清中发现7个外泌体miRNA (hsa-miR-486-5p、hsa-miR-451a、hsa-miR-660-5p、hsa-miR-363-3p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-16-2-3p及hsa-miR-15b-5p) 的敏感度均≥83.33%，特异性均≥87.50%，AUC均≥0.88，且与健康志愿者的表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)，说明血清外泌体miRNAs有成为早期诊断NSCLC的潜力。但化疗后NSCLC患者血清中无可用于鉴别与健康志愿者的特异性外泌体miRNAs。

余昌敏等[13]研究发现，NSCLC患者血清中3个miRNA(hsa-miR-451a、hsa-miR-331-5p及hsa-miR-363-3p)可依靠100%的特异性和敏感度来鉴别出治疗前的NSCLC和小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)患者。说明这些血清外泌体中对于NSCLC诊断具有高敏感度的miRNAs同时还具有鉴别SCLC和NSCLC的能力，有望在不久的将来成为NSCLC早期筛查诊断的生物学标志物。Jin等[14]研究发现，NSCLC患者血浆外泌体中的miR-24-3p、let-7b-5p及miR-486-5p含量明显高于健康对照者但let-7e-5p水平较其降低。为进一步研究及证明外泌体miRNAs对NSCLC早期的诊断价值，Jin等联合其他团队对60例尚未确诊的NSCLC患者血浆中let-7e-5p、let-7b-5p、miR-486-5p4及miR-23a-3p等外泌体的差异性表达进行检测，最终鉴别出43例NSCLC患者，因此，外泌体相关miRNA这种无创且高敏感度的诊断方法可提高NSCLC的早期诊断率。此外，Su等[15]查阅文献发现，利用qPCR技术和miRNA测序检测42例健康志愿者及41例Ⅰ期NSCLC患者血浆外泌体中的Ct值及其miRNA，以筛选诊断NSCLC的特异性miRNA，结果发现miR-361b-5p、miR-181b-5p、miR-320b及miR-10b-5p这4种miRNA具有鉴别NSCLC、肺鳞癌及肺腺癌患者的能力，说明外泌体中的miRNA在肺癌的诊断及鉴别诊断中发挥着重大作用，并为寻找诊断早期NSCLC的生物学标志物提供理论依据，进而可能会代替组织活检成为诊断NSCLC的非侵入性分子标志物。

美国Exosome Diagnostics公司于2016年初研发的基于血浆外泌体的间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)试剂盒已被相关机构批准用于临床，这是世界上第1个以血浆为样本分析外泌体RNA的临床检测[16]。它可以实时、准确地检测NSCLC患者EML4-ALK融合基因突变的情况，该项检测也被证明具有高达100%的诊断特异性和88%的诊断敏感度。

2.外泌体相关蛋白质与NSCLC的诊断：据研究报道，外泌体中除miRNA外的特异性蛋白质也可以作为诊断筛查NSCLC的生物学标志物并可促进NSCLC的发生、发展，是早期诊断NSCLC的有效途径。有研究者对NSCLC患者和健康志愿者血清ELISA检测时发现，ECM1及AH-SG外泌体蛋白在NSCLC患者与健康志愿者间的表达比较，差异有统计学意义，特异性为56.6%，敏感度为75.0%，AUC为0.656 (95% CI:0.528～0.785)[17]。他们还将ECM1和AH-SG联合进行检测发现，NSCLC及早期NSCLC患者，特异性为54.3%，敏感度为87.5%，AUC为0.739 (95% CI: 0.621～0.858)，这显著提高了NSCLC患者诊断的敏感度。另有报道称，NSCLC患者血浆外泌体中高表达的EGFR、CD91及CD317等蛋白均可作为NSCLC早期诊断的生物学标志物且多个外泌体蛋白标志物联合检测对NSCLC诊断更具优势[18]。

近年来，基于质谱的高通量蛋白质组学的研究使得对NSCLC外泌体蛋白质的筛选方法提升到了新的高度，这为我们提供了更多具有生物学标志物价值的分子。Clark等[19]运用稳定同位素标记氨基酸的方法检测并分析了NSCLC患者和健康对照者支气管上皮细胞外泌体之间的721种生物蛋白的差异性表达，筛选出了溶质载体家族3成员2、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、溶酶体膜糖蛋白2及癌胚抗原相关黏附分子6等多种对NSCLC诊断筛查具有高特异性和敏感度的蛋白标志物，若将其开发并应用于NSCLC患者液体活检的外泌体蛋白诊断芯片，较单一的生物学标志物将具有更高的开发和诊断价值。Sandfeld-Paulsen等[20]研究了127例健康对照者和336例肺癌患者血浆外泌体中49种蛋白表达情况后发现，CD151、CD171及TSPAN8不仅能作为区分肺癌组织与正常组织鉴别诊断的生物学标志物，同时对于区分各种肺癌组织的亚型也具有较高的价值。进一步研究发现，这3种蛋白联合应用时诊断NSCLC的AUC可达0.74。目前对诊断筛查NSCLC外泌体蛋白虽有了一定的成就和较多的研究报道，但已筛选出的蛋白生物学标志物尚需开展进一步的临床验证，相信随着蛋白质组学研究的不断深入，用于诊断NSCLC外泌体蛋白的标志物将会被不断被发现。

3.其余外泌体相关内容物与NSCLC的诊断：外泌体中除miRNA、蛋白质以外的其他分子如环状RNA(circRNA)、长链非编码RNA(lncRNAs)也有望成为诊断NSCLC的生物学标志物。Li等[21]研究发现，NSCLC细胞和组织中circRNA_0000735的表达量均明显升高，且其表达与淋巴结浸润及TNM分期有关。进一步研究发现，circRNA_0000735可显著提高NSCLC细胞的增殖、迁移及侵袭能力，又可明显抑制癌细胞的凋亡。其机制可能为circRNA_0000735与miR-1179/1182结合，从而发挥了生物学功能。另有一项研究显示，SNHG6作为19个LAPro LncRs中的其中一个，在NSCLC患者血浆中的表达呈异常状态，故可能作为NSCLC中肺腺癌的非侵入性检测的一个生物学标志物[22]。

三、外泌体在NSCLC治疗中的作用

近年来，外泌体所介导的治疗肺癌的新方式备受青睐和关注。研究表明，外泌体及其相关成分对NSCLC的治疗有着较高的应用价值及较好的发展前景。

1.外泌体所介导的肿瘤疫苗的开发：肿瘤疫苗是近年来研究的热点之一，它是一种活性生物前体。当NSCLC细胞相关抗原刺激抗原递呈细胞时，树突状细胞等抗原递呈细胞则会产生大量携带有特异性癌抗原的外泌体，随着外泌体迁移到附近区域淋巴结便可激活产生强大抗肿瘤免疫反应的CD4+和CD8+T的淋巴细胞[23]。有临床研究证明，表皮生长因子疫苗对NSCLC的治疗具有较好的疗效[24]。另外也有临床试验证实，治疗性疫苗(belagenpumatucel-L)对于NSCLC晚期患者来说可适当延长其生存期[25]。因此对于NSCLC的治疗，外泌体所介导的肿瘤疫苗可提供新的思路。

2.外泌体可抑制原癌基因表达：研究发现，NSCLC相关原癌基因的表达可被外泌体有效抑制，从而对NSCLC的治疗发挥作用。有研究报道，RNA干扰技术(RNA interference, RNAi)的使用能使IGF-1R、AKT1、NUPR1、WT1等肺癌相关原癌基因保持沉默，并可加速NSCLC相关miRNA的降解[26，27]。因此，通过外泌体抑制NSCLC相关致癌基因的表达也将为NSCLC的预防和治疗提供新的思路。

3.降低NSCLC细胞外泌体及其内容物的含量：因NSCLC细胞分泌的外泌体及其内容物在肺癌的发生、转移和演进中发挥着重要作用，因此减少外泌体及其内容物的含量或抑制NSCLC细胞对外泌体的分泌也可成为治疗的新靶点。研究表明，NSCLC细胞分泌的外泌体能进一步分泌生存素，其可有效促进NSCLC细胞生长并抑制NSCLC细胞凋亡，生存素基因负性突变体(survivin-D53A)的使用可抑制NSCLC细胞分泌的外泌体分泌生存素，间接抑制了NSCLC细胞的生长、促进了其凋亡，有望成为潜在的基因治疗药物。Li等[28]研究发现，中性鞘磷脂酶2(neutral sphingomyelinase 2，nSMase2) EPI64能有效抑制小鼠体内肺癌细胞相关外泌体的分泌，故EPI64可作为NSCLC治疗的靶点。

4.外泌体可增强NSCLC患者对化疗药物的敏感度：也有一些研究证实外泌体可增强NSCLC患者对化疗药物的敏感度，如Aqil等[29]研究发现，装载于外泌体中的植物萃取物雷公藤红素能有效抑制肺癌细胞的增殖，同时可增强NSCLC患者对化疗药物的敏感度并减少毒性不良反应。

四、展 望

随着人们对外泌体不断地探索和研究发现，其在NSCLC的诊疗等方面有着巨大的前景和临床应用价值，相信不久的将来便会广泛地应用于临床，以达到延长NSCLC患者生存时间和改善NSCLC患者生存率的目的。然而，如何寻找外泌体的靶基因、如何标记、提取、分离和纯化外泌体以及如何提高外泌体对NSCLC诊断和治疗的特异性及敏感度等诸多问题仍需广大研究者不断探究和解决。综上所述，外泌体对NSCLC的诊断和治疗拥有广阔的前景，相信更多的外泌体研究成果能更有效、更精准地应用于临床，以造福更多的NSCLC患者。