多发性骨髓瘤有氧糖酵解的研究进展

杨夏影 马银娟 师丽丽 吉小凡 潘耀柱

多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一种浆细胞恶性克隆增殖性疾病，是临床上常见的全身性血液系统疾病之一，仅次于淋巴瘤，多发于老年，目前仍无法治愈[1]。复发或难治性MM患者中位总生存期仅有8个月[2]。常见的症状包括骨髓瘤相关器官功能损伤的表现，即“CRAB”症状[血钙增高(calcium elevation)、肾功能损害(renal impairment)、贫血(anemia)、骨病(bone disease)]以及继发淀粉样变性等[1]。因此寻求新的治疗策略迫在眉睫。目前以18F-FDG作为标准核医学成像方式的PET/CT越来越多地应用于MM的早期诊断、疗效评估、预后判断以及LDH在修订的国际分期系统(R-ISS)中被视为影响预后的独立危险因素[1,3]。相信糖酵解酶与MM的发生、发展有着千丝万缕的联系。故本文就有氧糖酵解在MM中的研究进展进行综述如下。

一、有氧糖酵解途径

1924年，德国生物化学家Otto Heinrich Warburg研究发现，肝癌细胞的糖酵解较正常肝细胞活跃，并首次提出在氧气充足条件下，恶性肿瘤细胞糖酵解同样活跃的观点。这种有氧糖酵解的代谢特征被称为瓦博格(Warburg)效应。正常细胞在有氧条件下通过氧化磷酸化代谢葡萄糖，1mol葡萄糖彻底氧化净生成30mol或32mol ATP，而通过糖酵解途径最终只能生成2mol ATP。糖酵解是一种低产能的代谢模式，为何肿瘤细胞却如此偏爱后者？研究发现，代谢最终产物乳酸形成的酸性微环境有利于肿瘤细胞的迅速生长及远处转移；用于满足恶性增殖的生物大分子可以通过糖酵解中间代谢产物进行合成；抑制了线粒体功能可使活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成减少，从而减轻ROS的细胞毒性以抵抗凋亡[4]。那么，葡萄糖是如何进入细胞代谢并生成乳酸及ATP的呢？首先，葡萄糖进入细胞是在葡萄糖转运蛋白(glucose transporters，GLUTs)的辅助下实现的；其次，在己糖激酶(hexokinase，HKs)、磷酸果糖激酶(phosphofructokinase，PFKs)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PKs)等关键酶调控下促进丙酮酸生成并逐步释放能量，最终生成的丙酮酸经三羧酸循环途径代谢或者由乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase, LDHs)催化生成乳酸。在此过程中，由限速酶参与的不可逆反应起了重要的调节作用。

二、葡萄糖转运蛋白与MM

葡萄糖吸收入血后首先进入细胞，这是依赖GLUTs实现的。GLUTs由13个成员、3个亚类组成，包括作为葡萄糖转运体的GLUTs：GLUT1、GLUT2、GLUT3、GLUT4；作为果糖转运体的GLUTs：GLUT5、GLUT7、GLUT9、GLUT11；结构不典型且迄今定义不明确的GLUTs：GLUT6、GLUT8、GLUT10、GLUT12和肌醇转运蛋白(HMITL1)。有研究证实，与非恶性肿瘤组织比较，GLUT1、GLUT3、GLUT4、GLUT6在恶性肿瘤中表达上调，如子宫内膜癌、乳腺癌等[5]。在营养缺乏的癌细胞中，Akt信号增加可过度表达GLUT1，PI3K/Akt信号通过GLUT1膜定位调节葡萄糖摄取增加糖酵解速率，由此对抗细胞凋亡。GLUT1的表达也因缺氧诱导因子(HIFs)的增加而增加。Matsumoto等[6]研究发现，一些骨髓瘤细胞系如NCI-H929和RPMI8226细胞通过GLUT1结合葡萄糖，与正常细胞比较增加了葡萄糖摄取能力。应用GLUT1特异性抑制剂STF-31后发现，GLUT1高表达的骨髓瘤细胞死亡，而对GLUT1低表达细胞，如来自健康供体的外周血单个核细胞(PBMC)没有显示毒性作用。这一结果表明，STF-31诱导的细胞凋亡与细胞内葡萄糖缺失相关且与GLUT1的表达水平呈正相关。同时协同STF-31增强了美法仑(Mel)、阿霉素和硼替佐米(Bort)诱导的细胞死亡。GLUT4对MM细胞存活也是非常重要的。McBrayer等[7]进行基因表达谱研究，发现MM中失调的GLUTs家族成员，并证明骨髓瘤细胞依赖结构性细胞表面定位的GLUT4来消耗基础葡萄糖，维持Mcl-1表达、细胞生长和存活。随后Cao等[8]对MM细胞增殖与GLUT4表达之间的关系进行了研究，通过抑制基因转录途径中关键因子PGC-1α降低了GLUT4的表达，抑制了RPMI8226细胞的增殖。由此可知，不同或相同的骨髓瘤细胞可能表达不同的GLUTs，故在应用GLUTs靶向治疗时应评估负责肿瘤细胞葡萄糖摄取的转运体。

三、糖酵解关键酶与MM

1.己糖激酶(HKs)：葡萄糖进入细胞后发生磷酸化反应，生成葡糖-6-磷酸(G-6-P)，该反应不可逆，是糖酵解的第1个限速步骤，由HKs催化，Mg2+参与。HKs已知有5种不同的类型，是由不同染色体的不同基因控制。在哺乳动物中分别为HK1、HK2、HK3、HK4、HK5，又称己糖激酶结构域蛋白1(HKDC1)，HK1和HKDC1基因首尾相连排列，显示它们是通过串联基因复制而形成的产物。研究发现，HK2在多种实体瘤中高表达，如肺癌、胰腺癌、肝癌等。在哺乳动物正常细胞中低表达，也是HK2抑制剂临床应用的基础。HK2不仅可促进葡萄糖发生磷酸化反应，在MM细胞中，高表达HK2与线粒体外膜中的电压依赖性阴离子通道(VDAC)相互作用，并驱动糖酵解途径。细胞周期蛋白D1与HIF1α结合在基因转录水平上控制了HK2的表达并通过增强糖酵解途径及新生血管的形成，导致MM细胞具有抗凋亡表型[9]。除此之外，Ikeda等[10]研究发现，在MM细胞中，缺氧诱导HK2的高表达，并通过HK2-mTORC1途径调节细胞自噬功能由此对抗细胞凋亡。因此靶向HK2具有重要的临床意义。

研究发现，HK2抑制剂3-溴代丙酮酸(3-BrPA)可导致骨髓瘤细胞内ATP严重耗竭及抑制药物流出转运蛋白，具有显著的抗肿瘤作用。与Bort协同增强了促细胞凋亡作用；与Bort联合增强了后者在耐药患者中的促细胞凋亡作用，单用也具有同样效应。研究还发现，HK2抑制剂非诺贝特、葡萄糖类似物2-脱氧葡萄糖(2-DG)等均具有显著的抗肿瘤作用并应用于治疗舌肿瘤及晚期肺癌、乳腺癌的临床实验中[11]。除3-BrPA外，希望有更多安全的HK2抑制剂应用于MM临床实验中。此外，HK2的表达与MM预后具有显著相关性。Caillot等[9]通过数据分析发现HK2高表达，MM患者的无事件生存期(EFS)和总生存期(OS)明显缩短。Abe等[12]对90例初诊的MM患者进行分析并首次发现低表达HK2相关的假阴性PET/CT与患者较好预后具有相关性。

2.磷酸果糖激酶(PFKs)：PFKs又称6-磷酸果糖激酶-1(PFK-1)是糖酵解的第2个关键酶，催化果糖-6-磷酸转变为果糖-1,6二磷酸(F-1,6-BP)，该反应不可逆，是糖酵解的第2个限速步骤。在人类中有3种亚型：PFKL(肝脏型)、PFKM(肌肉型)和PFKP(血小板型)。PFK-1的动力学和调控特性是由细胞内不同亚基的类型和比例所决定的。PFK-1活性受细胞内中间代谢产物调节，如ATP、ADP、果糖-6-磷酸和果糖-2,6-双磷酸(F-2,6-BP)。与正常细胞比较，来自大鼠甲状腺癌、人白血病及胶质瘤的PFK-1受F-2,6-BP的激活更敏感。PFKFB-PFK-2/果糖二磷酸酶-2，是负责F-2,6-BP合成和降解的双功能酶。PFKFB3普遍表达且具有较高的激酶活性，其通过促进F-2,6-BP的合成，间接影响PFK-1的表达是调控糖酵解速率至关重要的方式。

Liu等[13]在人MM细胞系RPMI8226、ARP-1、OPM2及健康志愿者的PBMC中发现，与对照组比较，PFKFB3在MM细胞系中的表达更高，通过抑制PFKFB3，降低了细胞内F-2,6-BP水平，从而抑制葡萄糖摄取并加速MM细胞的凋亡。3PO作为PFKFB3的小分子拮抗剂可部分和短暂减少糖酵解,且对正常组织无严重毒性作用。PFK15作为3PO衍生物，具有更高的选择性，抑制效果增加了约100倍，与二甲双胍联合具有协同抗骨髓瘤作用。PFK158是一种新型PFKFB3抑制剂并在实体瘤中进行Ⅰ期临床试验(NCT02044861)，目前尚未报道出严重的不良事件，有望用于多发性骨髓瘤的治疗[14]。此外，研究发现，在乳腺癌中存在PFK-1类型转换，即从PFKL到PFKP是糖酵解程度增强主要因素[15]。在急性髓性白血病中发现PFKL水平可显著升高。Ganapathy-Kanniappan等[16]应用临床样本以及实验模型发现肺癌中的PFKP表达与OS相关，PFKP的下调具有显著抗癌效应。那么，骨髓瘤中是否也存在类型转换及关键酶作用如何仍有待进一步研究。靶向PFK-1在骨髓瘤治疗方面具有广阔前景，未来也有望成为疾病监测的重要指标。

3.丙酮酸激酶(PKs)：PKs是糖酵解的第3个限速酶，作用于有氧糖酵解途径的倒数第2步，催化磷酸烯醇式丙酮酸转变为丙酮酸，此反应不可逆。PKs包括4种同工酶：PKL型(肝脏型)、PKR型(红细胞型)、PKM型(肌肉型)，M型又分为M1型(PKM1)和M2型(PKM2)。PKM1和PKM2是由PKM基因经不同剪接方式编码而生成的产物。PKM2低活性的二聚体形式有助于癌细胞增殖所需物质积累；高活性的四聚体形式具有很强的催化活性，导致ATP合成和分解代谢。PKM2主要分布在快速增殖的胚胎组织和肿瘤细胞，在细胞质及细胞核中均有分布。先前有研究报道PKM2主要在细胞核中发挥作用，主要与细胞增殖相关。然而，He等[17]利用PKM2 siRNA转染RPMI8226细胞后发现，PKM2表达降低，细胞周期阻滞，生长速率明显受抑。利用PKM2 siRNA干扰RPMI8226和U266细胞，PKM2下调提高了细胞的黏附率，黏附状态下的MM细胞 PKM2核聚集，且对Bort、Mel和米托蒽醌(Mito)的敏感度低于悬浮细胞，从而证实了通过沉默PKM2提高了细胞黏附率并促进耐药性的产生，其可能通过核PKM2发挥药物抵抗作用。

目前PKM2在MM中的研究尚不充分，具体作用机制有待于进一步探索。在MM中,为适应其增殖和代谢需要，也存在PKM1向PKM2亚型的转变。Gu等[18]在NEK2过表达的人骨髓瘤细胞ARP1、OPM2中研究发现，NEK2通过与异质性胞核核糖核蛋白(hnRNP)A1/2的相互作用调控了MM细胞PKM未成熟RNA的选择性剪接，上调了PKM2的表达，增加了PKM2/PKM1的比值，促进了有氧糖酵解，促进了细胞增殖并增强了其致癌活性。同时对351例新诊断的MM患者进行了EFS和OS的Kaplan-Meier分析显示，高NEK2、PKM2组的EFS和OS明显缩短。由此而知，PKM2与MM的发生、发展关系密切。靶向PKM2在治疗MM中有望成为有效的治疗措施，还需更多的基础和临床研究来探索。

4.乳酸脱氢酶与MM：LDHs是乳酸生成的关键酶也是细胞有氧糖酵解的关键限速酶之一。LDH是一类烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性激酶，由LDHA、LDHB、LDHC 3种亚基组成。哺乳动物LDH是由4个亚基组成的四聚体，常见的A、B两种亚基构成的5种同工酶，即LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5。对不同的底物有不同的反应性。而C亚基则仅组成一种LDH同工酶即LDH-C4(特异性存在于哺乳动物生殖细胞)。LDH主要存在于细胞内，当细胞受损时，就会被释放入血，导致血清LDH水平增高。LDH通常在造血系统恶性肿瘤患者中升高明显，如霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)或MM。其中LDHA与癌症的发生、发展具有高度相关性。

与正常细胞比较，在MM细胞中，LDHA过表达导致细胞具有以糖酵解为主的新陈代谢，其通过增强LDH酶的活性、乳酸的产生，从而促进细胞增殖，且与氧气供应无关，PGC1β在此过程中起到了正性调控作用[19]。此外，LDHA的表达还受miR-489影响。研究发现，高表达miR-489通过下调LDHA，具有抑制葡萄糖摄取、乳酸分泌和ATP产生的作用，从而抑制有氧糖酵解并导致MM细胞增殖减少[20]。在肿瘤免疫中，乳酸生成能够调节肿瘤细胞微环境(TEM)并通过阻止下游通路间接抑制肿瘤细胞的免疫应答，抑制机体免疫功能，从而帮助细胞发生免疫逃逸。同时酸性TEM的形成，有助于肿瘤细胞的增殖和转移[21]。因此，靶向LDHA是抑制肿瘤细胞转移，延缓疾病进展的基础。草氨酸盐、棉酚、棉酚衍生物-FX11、陪黄素等是目前公认的LDHA抑制剂，在乳腺癌、肝癌、非小细胞肺癌等多种肿瘤细胞中具有很好的抗肿瘤作用，但由于缺乏特异性、作用较弱、不良反应多且具有明显的毒性不良反应等特点限制了其在临床的应用[22]。在同样高表达的MM中这些药物是否有效且不影响周围正常组织有待于进一步研究。

四、展 望

MM不仅是基因病也是能量代谢异常性疾病。现有研究发现，在MM中葡萄糖转运蛋白GLUT、糖酵解关键酶——HK、PFK、PK及乳酸生成关键酶LDH在肿瘤细胞能量代谢过程中发挥了重要作用。当前复发难治性成为严重影响MM患者生存质量及预后的关键因素。由于此类患者缺乏标准化治疗方案，个体化治疗又显得尤为重要。如何及时有效掌握病人的病情变化，选择合适的治疗方案是目前急需解决的问题。GLUT、HK、PFK、PK与MM的发生、发展关系密切，未来有望成为临床诊治MM的重要生物学标志物并用于指导临床。