数字PCR技术在动物疫病检测中的应用

陈林军，崔 强，于志超，李军燕，罗晓平，王海艳，延 涵，刘 丹，赵治国

（1.呼和浩特海关技术中心，内蒙古 呼和浩特 010020；2.广东海洋大学滨海农业学院，广东 湛江 524088；3.内蒙古自治区农牧业科学院兽医研究所，内蒙古 呼和浩特 010031）

近几十年来，基于分子生物学技术，已经建立了许多核酸检测方法应用于动物疫病的实验室检测。这些方法优点较多，通常其敏感性及特异性高，并且提供了更简单的标准化检测程序。实验室核酸检测方法，包括普通PCR、巢式PCR（nested PCR）、限制性片段长度多态性PCR（PCR-restrictionfragment length polymorphism，PCR-RFLP）、随机扩增多态性DNA（random amplifed polymorphic DNA，RAPD）、扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）、环介导等温扩增 （loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、多重连接依赖性探针扩增（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）、高分辨率熔解曲线（high resolution melting，HRM）以及DNA测序［1-4］。上述方法有些已成功用于动物疫病实验室的检测，但是有的灵敏度仍然受到自身技术限制，尤其是在低丰度样本及复杂性样品检测中。近些年，数字PCR（digital PCR，dPCR）已被用于核酸检测，例如转基因成分分析、动植物产品检测等［5-6］，特别是在肿瘤学诊断中其显示出了巨大潜力［7-8］。尽管dPCR在动物疫病实验室检测领域的应用相对不及医学领域的快速发展，但该方法可能在将来诊断和控制动物疫病中发挥重要作用，未来将需要更精确灵敏的诊断手段来支持流行地区的动物疫病控制，以及在动物疫病非流行地区所进行的流行病学监测。

1 原理

dPCR能够对样品中存在的目标核酸进行绝对定量，避免了qPCR的不足［9］。dPCR，首先通过预处理，将样品稀释和分配到多个独立分区中，通过创建“油包水”乳液（微滴式数字PCR）、使用具有微通道的芯片（微流控芯片数字PCR）或微流体芯片（微滴芯片式数字PCR）实现分区，每个分区包含很少或者没有目标序列；然后，每个分区充当单独的PCR微反应器，PCR扩增后，每个分区被量化为具有或不具有靶序列，即为阳性（1）或阴性（0）结果；最后荧光检测包含扩增靶序列的分区，根据泊松分布原理以及阳性分区与总数的比值确定样品中待检靶分子的浓度或拷贝数［10-12］。因为样品分配可有效地将目标序列集中在分隔的微反应器中减少了模板竞争，能够检测稀有突变以及痕量核酸；此外，它还允许PCR扩增反应对样品中存在的抑制剂具有更高的耐受性［13］。根据反应单元形成方式的不同，数字PCR主要可分为微滴式数字PCR、微流控芯片数字PCR和微滴芯片式数字PCR等。

1.1 微滴式数字PCR

微滴式数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）基于乳液PCR（emulsion PCR）技术［14］，通过油水不相容的原理，油形成油膜将水包裹在其中，形成一个个微滴作为反应室。微滴发生器可将样品生成数万乃至百万个纳升甚至皮升级别的单个油包水微滴，每个微滴都成为一个独立的反应器，随后微滴完成PCR扩增，最后微滴分析仪对微滴逐个进行荧光检测。相比阴性微滴，包含至少一个目标核酸分子的阳性微滴的荧光信号强度增加，最后根据泊松分布，通过阳性微滴的比例给出目标分子的绝对拷贝数［15-16］。微滴式数字PCR过程通常包括微滴生成、微滴反应以及微滴检测3个过程，但也有将3个过程高度集成的设备，如Bio-Rad QX ONE数字PCR系统整合了微滴生成、热循环反应及微滴读取等步骤，最大程度减少人工操作，还配备4个独立的荧光检测通道提高了实验通量。

1.2 微流控芯片数字PCR

微流控芯片数字PCR基于微流控芯片技术，芯片由微米级流体的管道、反应器等元件构成，其结构极大地增加了流体环境的面积/体积比，可以最大限度利用液体与物体表面有关的特殊性能［17］。如由层流效应引发的微管道中液体的层流状态使得在非平衡状态下对微流体的操控成为可能，毛细效应、快速热传导和扩散效应使得微流控器件对样品流体具有高效的处理能力，从而芯片可快速并准确地将样品流体分成若干个独立的分区［18］。PCR反应之后，再读取每个独立分区得到荧光信号并计数。微流控芯片的优势是在一张芯片上就可以完成样品加样、预处理、PCR、检测等系列过程。目前使用微流控芯片技术的数字PCR系统主要有Fluidigm公司的Biomark HD基因分析系统、Thermo Fisher Scientific公司的QuantStudio 3D数字PCR系统［19］。微流控芯片数字PCR在医学临床主要应用领域是进行多基因位点平行检测以指导临床用药。

1.3 微滴芯片式数字PCR

以主流的法国Stilla Technologies公司开发的Naica Crystal全自动微滴芯片数字PCR为例，由微滴生成/扩增仪和微滴阅读分析系统组成，全程仅需唯一耗材，即Sapphire芯片（cutting-edge微流体芯片），可封闭式完成从加样、微滴生成和扩增，到采集数据获得结果的全程。先将PCRmix加入芯片，再置于微滴生成扩增系统反应，即可自动获得25 000～30 000个均匀一致的微滴，且以单层平铺方式形成2D阵列；进入PCR扩增步骤，无需将生成微滴转移至PCR管中；随后使用微滴阅读分析系统和专用软件对微滴成像，用以检测包含扩增片段的微滴，通过对阳性微滴计数从而得到核酸绝对数量［20］。基于Naica数字PCR平台开发的针对新型冠状病毒（2019-nCoV）的高度特异、高灵敏的数字PCR绝对定量检测方法，可降低由假阴性带来的病原扩散潜在风险。

2 应用

在进行核酸绝对定量时，数字PCR技术因极高的灵敏度，充分弥补了依靠Ct值（qPCR技术）不能达到较好分辨效果的不足。在动物疫病检测中，可以用与qPCR相同的反应混合物和循环条件设计dPCR方案，使结果更准确，从而可以进行更精确的诊断。

2.1 dPCR在细菌性动物疫病检测的应用

梅力等［21］建立的布鲁菌微滴数字PCR检测方法，最低检测下限可达1.12拷贝/μL，可对布鲁菌感染的临床样品进行定量检测。田国忠等［22］建立了布鲁菌微滴数字PCR方法，布鲁菌核酸DNA为3.68 fg/反应时，ddPCR检出靶标基因拷贝数可达1拷贝/反应，可检测微量核酸DNA。Song等［23］利用ddPCR检测结核分支杆菌特异性基因（M.tb-specific CFP10），对于ddPCR，CFP10的检测限为1.2拷贝/μL，而qPCR为15.8拷贝/μL。王建峰等［24］针对幼虫芽孢杆菌16SrRNA基因建立幼虫芽孢杆菌微滴式数字PCR检测方法，检测灵敏度可达2.9拷贝/μL。

2.2 dPCR在病毒性动物疫病检测的应用

Zhao等［25］利用ddPCR检测法分别对副痘病毒属（PAPV）目前已知所有病毒［羊口疮病毒（ORFV）、伪牛痘病毒（PCPV）和牛丘疹性口炎病毒（BPSV）］等进行了检测。Benjamin等［26］首次应用ddPCR技术在高通量样品条件下对二代测序技术进行验证。Boettger等［27］首次证明了ddPCR试验结论与NGS结论高度吻合。邬旭龙等［28］建立的非洲猪瘟病毒ddPCR方法，dd PCR的最低检测限度可达到0.36拷贝，灵敏度是qPCR的10倍。兰德松等［29］研究建立的dd PCR方法对PRV gD、gE基因的敏感性比相应的qPCR方法高10倍。董桂伟［30］建立了禽腺病毒检测方法，qPCR检出质粒标准品的最低浓度为100拷贝/μL，而dd PCR方法为10拷贝/μL。

2.3 dPCR在寄生虫病检测的应用

目前对于低丰度目标序列的检测，定量PCR、杂交等方法都因受到背景DNA的干扰，使得检测灵敏度及精确性都达不到精确定量的要求。与相同生物材料上进行的qPCR相比，dPCR显示出高灵敏度的检测，尤其是在含有PCR扩增抑制剂的样品中，如对粪便中隐孢子虫的定量分析［31］。dPCR在要求高精度进行定量检测的诊断中是一种较有效的方法，例如临床样品中的寄生虫负荷，以及患者之间或在不同时间点采集的样品中寄生虫的统计比较。在血吸虫病检测中，某种程度上dPCR结果能够更早和特异性检测到日本血吸虫［32］。据报道，dPCR检测法是检测和定量核酸小片段（例如cfDNA和micro-RNA）的新方法，是一个有希望的潜在诊断应用，尤其是在针对血吸虫病消除的国家和地区［33］。Yu等［34］建立羊鞭虫病的早期诊断检测方法，对于重组质粒，qPCR结果显示每个反应的检测限为31.7拷贝，而ddPCR能够检测到每个反应低于3.17拷贝的浓度。

2.4 dPCR在动物疫病检测其他方面的应用

在标准物质研制领域，生物标准物质的研制逐渐成为研究热点，同时基于核酸检测技术的开发与应用推动了核酸标准物质的进程。核酸标准物质即为用于核酸扩增技术的标准物质，是生物标准物质的一种。核酸标准物质在医疗诊断、转基因检测、生物安全等方面有着极大的发展空间。标准物质具有通用属性，可以用于定性检测，也可以用于定量检测。核酸标准物质需要高级别精准的定值方法，数字PCR作为单分子定量技术得到了广泛的应用。与qPCR不同，dPCR不需要依赖分析样品和参考标准品间的标准曲线进行绝对定量分析，并可用于qPCR测定参考标准品绝对定量［35］。国内已有研究通过数字PCR法制备出了猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪塞内卡病毒、非洲猪瘟病毒等国家二级标准物质［36-39］。采用高精确度的数字PCR技术替代荧光定量PCR技术进行定值，充分保障了定值结果的可靠性和技术权威性。此外，dPCR被越来越多地用于定量分析包括单核苷酸多态性（SNP）在内的序列变异，用于检测稀有基因序列，分析药物敏感性和进行人畜共患病筛查。

3 存在的问题及发展趋势

目前，数字PCR技术依靠其绝对定量的技术优势已经在各个领域崭露头角，但是也面临一些挑战。多路荧光通道方法依赖特定的平台，dPCR平台以及扩增混合物试剂的选择可能会受到限制，具体取决于可用的商用仪器。尽管dPCR优于qPCR，但它不可能在临床实验室中完全取代qPCR。一些研究表明，在高核酸浓度下dPCR可能变得饱和，因此其性能比qPCR差，这强调了适当稀释的重要性［40-41］。多重PCR是在一个样本中可以获得各种信息的方式，可充分利用极少量的和难以获得的生物样品，尤其是临床样本，减少病例的痛苦及经济负担。目前，伯乐QX200检测通道可覆盖双通道（FAM/HEX），新推出的QX ONE系统配备4个独立的荧光检测通道检测；BioMarkHD选配IFC微液流芯片（耗材）-Digital Array最多能兼容4种荧光染料进行多通道PCR；QuantStudio 3D系统支持多色荧光系统（FAM/VIC）；Naica数字PCR系统已经在多重方面使用了三通道技术；关于更多通道的需求各大厂商也在继续研发中。

目前，另外一个弱势是新技术使用的接受度，成熟方法以qPCR为主，传统数字PCR方法和qPCR方法相比，操作太过复杂和获得数据时间更长，耗材成本高。因此，一些实验室仅使用dPCR进行标准品的精确定量，而qPCR仍然是常规技术。迄今为止，dPCR在传染病，尤其是动物疫病诊断中的临床应用仍不广泛。根据大多数研究，相对于qPCR，dPCR带来的最积极的改进是，dPCR提供了无标准曲线的绝对定量分析，对低负荷DNA更为敏感。一些证据表明，dPCR测定法在疟疾控制程序领域或输血医学领域有望用于无症状和低密度感染中的寄生虫血症测定［42］。dPCR的技术缺点较少，但是迄今为止，当前dPCR平台的更大复杂性、较少的通量阻止了它在常规实验室中的应用。这需要仪器公司和研究人员对dPCR分析进行最佳配置规划，以克服当前在动物临床实验室中实施的局限性。伴随技术的发展，数字PCR成本必将逐渐降低，被大家广泛应用。

4 结语

随着dPCR技术与仪器的不断发展与创新，以及大量成熟产品上市应用，可以合理地预期，一旦技术变得更加普及，dPCR的设备和试剂的成本（目前高于qPCR的成本）将大大降低，更加简便、敏感、特异、高效以及可检测潜伏感染的dPCR分子诊断手段将是未来疫病检测诊断的发展趋势。