乙酰转移酶p300调节细胞因子在急性肺损伤中的研究进展

曾祥丽综述，张 红审校

0 引 言

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是急危重症常见的一种器官损伤，部分患者会进展成为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)，大大增加患者的死亡风险[1]。细胞因子是体内介导炎症的重要成分，在ALI的发生、发展中扮演重要角色。其中炎性细胞因子能够引发有效的炎症过程,加重局部肺水肿和肺组织损伤[2]。p300是重要的乙酰转移酶，能够通过乙酰化作用调节下游基因表达或蛋白功能，有研究证明，p300能够与CtBP2、NF-κB形成转录复合物，作用于巨噬细胞基因表达，表达与释放IL-1β、IL-6、IL-15、IL-18以及TNF-α等炎性细胞因子，形成细胞因子 “瀑布”，导致肺损伤[3]；说明乙酰转移酶p300参与了炎症细胞因子的调节。本文就p300调节细胞因子与ALI的关系作一综述，为研究ALI的发生机制及治疗提供新的思路。

1 p300与ALI

乙酰转移酶p300是一种能与腺病毒癌蛋白相互作用的蛋白质,在转录调控及蛋白修饰过程中起着重要的作用，参与细胞周期调控、细胞分化和细胞凋亡等多种生理过程，与人类多种疾病的发病机制有关[4]。p300主要包括TAZ1、KIX、BRD、CH2、ZZ、TAZ2、NCBD以及HAT 8个主要的结构域，这些结构域在一定条件下可相互作用，保证组蛋白乙酰化酶HAT活性[5]。p300通常被招募到染色质转录增强子附近，并通过乙酰化修饰调节基因表达[6]。目前已知p300/CBP能与400多个蛋白结合并相互作用[7]，能通过乙酰化组蛋白和非组蛋白的方式参与基因的转录调控。同时，能在转录因子和基本转录复合物之间起到桥梁作用，而且也能为整合多种转录辅因子提供支架。研究发现p300的3种主要生物学功能包括：①p300通过乙酰化组蛋白N端起到帽子作用，这种修饰导致染色质结构开放，并促进转录；②p300乙酰化酶是一种乙酰化非组蛋白转录因子，从而增强了其活性；③p300起转录激活作用，将转录因子引入目标基因的启动子区域，从而促进转录[8]。

有研究证明，ARDS患者急性期，血清中p300水平明显增高，并且在雄性C57BL / 6小鼠脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的ALI模型中，肺组织p300水平也是明显高于对照组，用p300特异性抑制剂C646处理后，肺组织的炎症可得到改善[9]。在加入LPS诱导人肺泡上皮细胞A549损伤后，p300 mRNA及蛋白表达水平均增加，Si-RNA转染敲低p300后，损伤细胞的活性得到恢复、细胞坏死减少，并且升高的IL-1β, IL-6, TNF-α等细胞因子蛋白水平降低，肺部炎症得到改善[10]。说明p300的表达与肺损伤的发生发展有关。

2 p300调节不同细胞因子在ALI中的作用

2.1 p300与IL-8IL-8主要由单核细胞和巨噬细胞分泌，可募集和活化中性粒细胞，参与炎症反应和细胞的杀伤作用。研究证明，p300可在IL-8启动子区域参与介导RelA/p65蛋白的乙酰化，这是IL-8激活的生理学基础之一[11]。蛋白酶激活受体激动剂可招募p300到达细胞核IL-8基因启动子区域的NF-κB p50亚基，正向调节IL-8的转录后修饰，促进IL-8的表达[12]。

研究发现，长链非编码RNA(lncRNA)转移相关肺腺癌转录本1(MALAT1)参与肺的缺血再灌注损伤并调节炎症[13]。沉默MALAT1进而通过乙酰转移酶p300介导的H3K27ac(Acetylation of K27 on histone H3)富集在IL-8启动子区域中，从而抑制嗜中性粒细胞的趋化性，可减轻肺移植后的炎症损伤。气道平滑肌细胞在哮喘发生后，可招募过多的乙酰转移酶p300，组蛋白H3赖氨酸残基18乙酰化水平增高[14]，同时调节此区域内CPG岛的去甲基化[15]，可促进IL-8的表达，导致炎症损伤。IL-8基因启动子附近组蛋白H3乙酰化也受PGE2、C/EBP-a和p300三元复合物的调节，可参与IL-8的表达，介导下游的炎症反应[16]。

p300亦能与各种蛋白形成复合物，共同调节IL-8的转录。研究发现，在人肺泡上皮细胞A549中，凝血酶可调节p300 的1834 丝氨酸残基位点磷酸化激活，进而激活p300依赖的组蛋白H3乙酰化，p300、C/EBPβ、p65形成复合物，被诱导向IL8/CXCL8启动子区域结合，促进IL-8的表达与释放[17]。在另一项人肺泡上皮细胞A549研究中也发现，凝血酶诱导p300、p65与C/EBPβ结合位点结合，促进p70S6K、p300和p65向IL8/CXCL8启动子区的κB结合位点募集，IL-8的表达与释放增加[18]。有研究证明，p300能够乙酰化特异蛋白SP-1，并和SP-1形成二元复合物，结合至IL-8启动子区域促进IL-8的表达[19]。p300可促进细胞因子IL-8的表达参与ALI的发生发展。

2.2p300与IL-6IL-6是一种多功能细胞因子，是由纤维母细胞、单核/巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞等多种细胞所产生。能够引起肺组织炎症及氧化应激[20]。在ARDS急性期，患者外周血p300 mRNA表达升高，进一步通过相关性分析发现，外周血p300的量与IL-6相关[21]。LPS诱导小鼠肺损伤后，经过肺损伤单核细胞与p300抑制剂A-485共培养后，可观察到A-485可减少LPS刺激的促炎细胞因子IL-6分泌[22]。另外用siRNA敲低p300后，促炎细胞因子IL-6的表达也明显受到抑制，肺损伤得到缓解。

p300可诱导C/EBPβ 39, 216和217赖氨酸残基乙酰化，而C/EBPβ可结合在IL-6基因启动子区域，激活其活性[23]。此外，p300/CBP相关因子(p300/CBP-associated factor,PCAF)表达水平升高能增加H3K9ac (Acetylation of K9 on histone H3)的乙酰化水平，进而刺激IL-6转录，促进炎症反应[24]。

LPS刺激后，H3K9ac,H3K14ac以及H3K4me3在IL-6基因附近富集增加，促进IL-6的表达。不论是用siRNA抑制p300转录组水平，或是用p300抑制剂C646抑制蛋白表达，IL-6的表达均明显受到抑制[25]。这说明组蛋白的乙酰化在p300调节IL-6表达在肺损伤中可能起重要作用。

研究表明，p300可促进NF-κB的p65磷酸化[26]，参与IL-6的表达。活性氧(reactive oxygen species, ROS)可促进NF-κB p65赖氨酸残基与p300形成共刺激复合物，并在RNA聚合酶Ⅱ的参与下，使得巨噬细胞基因组乙酰化，并向M1型极化，促进IL-6的分泌[27]，导致肺部炎症反应。

2.3p300与TNF-αTNF-α是一种多向性的促炎性细胞因子，由多种细胞分泌，包括活化的单核细胞、巨噬细胞、B细胞、T细胞等，可成为急性肺损伤分子机制的重要环节之一[28]。LPS诱导后，p300与TNF-α均显著高表达。加入p300抑制剂A-485后[22]，LPS刺激的促炎细胞因子TNF-α分泌减少。另外用siRNA敲低p300后，TNF-α的表达也明显受到抑制。使用质粒过表达p300后[23]，TNF-α的表达显著升高。

p300可促进NF -κB的p65磷酸化，参与TNF-α的表达[26]。有研究发现，活性氧ROS可诱导NF-κB p65赖氨酸残基与乙酰基转移酶p300形成共刺激复合物，并与RNA聚合酶II一起，乙酰化巨噬细胞基因组，促进TNF-α的分泌[27]，抑制p300后，随着组蛋白H3上K9赖氨酸残基的乙酰化水平的下降，TNF-α的表达也受到抑制[24]。由此可见，p300可通过乙酰化作用调节TNF-α的表达。

不仅如此，在不同情况下，TNF-α也能扮演p300上游刺激物的角色，一项实验表明，TNF-α刺激后，p300/CBP相关因子PCAF和H3K9ac蛋白的量较正常组织明显增多[29]。提示TNF-α可刺激 P300/CBP相关因子PCAF的表达。此外，TNF-α还可促进人THP-1单核细胞NF-κB的表达，通过招募p300及 P300/CBP相关因子 PCAF[30]，促进CCL2基因启动子附近H3、H4组蛋白的乙酰化，进而促进下游炎症反应。TNF-α的高表达可诱导PCAF的过表达，而PCAF可显著增强MKL1基因的乙酰化水平[31]，MKL1可诱导中性粒细胞向肺部浸润，参与肺损伤[32]。

可见，TNF-α也可作为p300的上游激动剂，参与肺损伤的炎症反应。p300与TNF-α在不同环境下能够相互作用，调节下游基因表达，参与肺损伤。

2.4p300与NF-κBNF-κB是炎症反应中的重要角色，其可调节编码炎性细胞因子的基因,如IL-6等，在ALI中起重要作用。p300可介导Stat3乙酰化，诱导NF-κB转录活性，调控基因表达，并诱导转录模式的改变，导致促炎症或凋亡基因的下调[33]。 p300乙酰化NF-κB p65蛋白后，与磷酸化STAT3一同募集到IL-6、TNF-α、环氧酶-2(Cyclooxygenase-2, COX-2)基因启动子附近，激活他们的活性，激活细胞的炎症信号通路[34]。研究发现，LPS可诱导小鼠肺的炎症反应，加入p300抑制剂A-485后，磷酸化p65蛋白的量明显减少，NF-κB抑制蛋白IκB的量明显增加，巨噬细胞中NF-κB信号通路受到明显抑制[22]。

在人肺纤维母细胞中，凝血酶诱导p300结合到CCL2的启动子，乙酰化H3、H4组蛋白，而且p300能够调节磷酸化NF -κB p65蛋白核转位，使其与CCL2启动子结合，促进CCL2的转录及翻译，从而促进肺的炎症反应[35]。而且，磷酸化p65 NF -κB蛋白升高可参与肺的缺血再灌注损伤[36]。

研究表明，高糖可刺激NF-κB p65进入细胞核，免疫共沉淀显示p300和NF-κB共定位到细胞核，并且两者共同结合乙酰化H3K9，富集于iNOS基因启动子，促进其表达，导致下游炎症反应[37-38]。此外，p300可乙酰化NF-κB p50蛋白，乙酰化p50更易结合到COX-2启动子，促进其转录[39]。研究表明，COX-2与可溶性环氧化物水解酶可参与LPS诱导的肺组织损伤[40]。

综上所述，p300可乙酰化NF-κB相关蛋白，如p65，直接参与肺的炎症反应。或者乙酰化NF-κB后，激活炎症相关基因或细胞因子的表达，如iNOS、COX-2，间接参与肺的炎症损害；此外，p300还可通过乙酰化NF-κB上游基因，如Stat3，使得NF-κB间接激活，参与肺损伤的发生及进展。

2.5p300与Th17/IL-17IL-17主要由Th17细胞分泌，它在上皮细胞表面表达，其激活可招募中性粒细胞到炎症部位以清除感染。然而，IL-17是重要的促炎因子，能够诱导炎症因子并促进炎症反应[41]，

如诱导上皮细胞、内皮细胞等合成分泌IL-6、IL-8等细胞因子，参与肺组织炎症；持续的免疫反应可能导致炎症反应的加重，引起进一步的组织损伤[42]。在小鼠模型中，抗IL-17治疗能够缓解脂多糖诱导的ALI[43]。

Chen等[9]从临床和脂多糖诱导的ALI 小鼠模型两方面研究证明了组蛋白乙酰转移酶p300 可调节维甲酸相关核孤儿受体γt (retinoic acid receptor-related orphan receptor gamma t, RORγt)的转录，其激活有助于Th17细胞的分化，参与ARDS急性期的炎症反应，并且，IL-17的表达与p300密切相关[21]。p300可使RORγt K81残基乙酰化，促进IL-17的转录[44]。Wang等[45]研究发现，JQ1是溴结构域和末端外蛋白家族的小分子抑制剂，能与溴结构域相互作用，抑制p300介导的RORγt乙酰化，从而在下调多个Th17细胞特异蛋白的表达，包括IL17、IL21和GM-CSF，缓解了日本血吸虫感染小鼠模型的肝纤维化程度。综上所述，p300可能通过调节IL-17的表达参与肺损伤。

3 结 语

ALI是临床上常见的严重肺部急症之一，多由严重感染、创伤、体外循环等导致，重要的病理改变是肺泡上皮细胞的损伤及肺间质的水肿；而多种细胞因子参与其中，共同形成肺组织的炎性环境，其形成的炎性“风暴”可导致全身炎症反应综合征，成为肺损伤的始动因素之一。乙酰转移酶p300能够通过直接乙酰化IL-8、IL-6、TNF-α、NK-κB、IL-17等细胞因子启动子区域调控其转录，或通过与上游、下游多种蛋白共同调节各种细胞因子的表达，参与肺损伤的发生及发展过程，开发p300及各细胞因子的联合抑制剂，有望成为预防及减轻ALI的方法。