循环肿瘤细胞在大肠癌诊疗中的研究进展

刘宏韬，周 黎综述，何 松，周智航审校

0 引 言

大肠癌(colorectal cancer，CRC)是我国最常见的恶性肿瘤之一，发病率及死亡率逐年上升。据估算，2018 年全球结直肠癌新发病例数约为184.95 万例，位居肿瘤发病率第3位，死亡例数为88.08 万例，位居肿瘤死亡率第2位[1]。目前大肠癌的筛查仍依赖于敏感性和特异性均不高的大便隐血及癌胚抗原(cancer embryonic antigen, CEA)等。此外，复发、转移是大肠癌治疗失败的主要原因，循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)是其中的关键环节[2]。与获取肿瘤组织样本相比，通过患者血液样本来检测CTC更加容易，并可反复采集，是临床上较为理想的标本来源。研究表明，CTCs可应用于大肠癌的预后、治疗反应以及肿瘤复发的检测等重要环节，具有巨大的临床应用前景。需要注意的是，目前最常用的检测CTC的方法是基于EpCAM等标志物，存在检出率较低、无法反映肿瘤异质性等问题，亟需更加高效、便捷的检测方法。本文结合近来国内外研究进展，对大肠癌CTC相关的文献进行综述。

1 CTC的检测技术

近年来全球已经开发了大量的技术来检测特定的CTC，但是由于这些细胞在血流中具有极端的异质性和罕见性，所以CTC的检测技术仍然具有挑战性，需要有更高灵敏度和特异性的方法来鉴定。CTC的检测方法可以基于其生物学特性(即细胞表面标记物)或物理特性(即大小、密度、电荷)，通常会与检测技术(如免疫荧光、免疫组化、FISH)相结合来检测CTC[3]。CTC检测的原理是依赖于分离肿瘤细胞中的正性富集或去除白细胞的负性富集。基于细胞表面标志物的方法中，最经典的是CellSearch系统，它是目前唯一被美国FDA批准的检测CTC的技术。 CellSearch系统通过EpCAM(上皮细胞黏附分子)包被的免疫磁珠在全血中捕获CTC，然后使用抗细胞角蛋白(CK 8、CK 18、CK 19)、抗CD45(白细胞标记物)和核染色(DAPI)进行荧光检测[4-8]。但这类方法还是遗漏了发生上皮间质转化或丢失EpCAM的细胞。

所以现在正在研究通过肿瘤细胞的物理特性来克服这种偏差。例如RosetteSep技术，去除血液中的白细胞后，在Ficoll-Paque PLUS密度梯度离心中分离得到CTC。ISET、ScreenCell以及我国的CanPatrol方法能够使用微孔聚碳酸酯过滤器检测CTC[9-10]，但是可能出现细胞堵塞等情况。近年来，基于微流控分离CTC成为新的热点。微流控系统能够根据细胞的大小、弹性等物理特性分离CTC，能够有效反映CTC异质性。例如CTC-iChip，它使用微流体去除红细胞后，用EpCAM偶联的微球正向富集CTC或用CD45抗体包被的微球负向富集CTC[11]。还有一些技术整合了多种方法，比如，DEPArray结合了微流系统和图像分析系统选择CTC[12-14]。上述每种方法都有自己的优点和局限性，而研究人员则可以根据CTC表型研究的具体目的，来确定CTC的捕获方法。

2 CTC的诊断价值

CTC能在病程早期进入循环系统。在CRC诊断过程中，通常需要检测非特异性血清标志物(CEA等)、内镜检查和腹盆腔CT扫描。而这些非特异性血清肿瘤标志物，如CEA、CA19-9和CA72-4，已被认为是CRC患者诊断、预后、监测复发和指导治疗的候选生物标志物[15]。在HAIJIAO YU的一项研究中，对59例CRC患者检测上述3种血清肿瘤标志物，发现CEA的诊断灵敏度最高(50.85%)，其次是CA72-4(28.81%)和CA19-9(23.73%)[16]。然而CTC的诊断灵敏度为83.05%，显著高于各种传统血清肿瘤标志物和组合。联合CTC和这3种生物标志物时敏感性达到93.22%。其中CTC+CEA组合的敏感性(91.53%)仅略低于4种标志物的联合敏感性，结果表明CTC+CEA可能是CRC诊断和预后的血清肿瘤标志物的有效组合。此外，作者观察到肿瘤分期与CTC和肿瘤标志物检出率之间的相关性。作者在34.38%的Ⅰ～Ⅱ期CRC患者、53.33%的Ⅲ期患者和91.67%的Ⅳ期患者中检出CTC，这些比率在所有病理分期均高于CA19-9和CA72-4的比例。此外，与正常个体相比，有78.13%的I-II期患者、86.67%的III期患者和91.67%的IV期的CRC患者观察到CTC水平升高(≥2个/3.2 mL),这与癌症不同分期的诊断敏感性升高相对应。再者，联合CTCs和CEA时，Ⅰ～Ⅱ期患者检出率达到84.38%。

与其他生物标志物例如ctDNA和外泌体相比，CTCs的诊断价值更有优势。首先，循环肿瘤细胞是从肿瘤中逃逸出来的具有活性的细胞，因此检测其中突变，能够大大降低人体细胞突变的背景噪音。其次，由于循环肿瘤细胞在癌症早期阶段即存在，因此研究循环肿瘤细胞能够更为有效的实现癌症的早筛。最后，目前大量的研究证明循环肿瘤细胞是癌症转移的罪魁祸首，识别循环肿瘤细胞上的标靶进行靶向治疗，不仅能够对原位癌实现治疗，也能大大减少癌症转移的风险。以上表明，CTCs是一种相对较好的疾病指标，可用于CRC的早期诊断并判断肿瘤分期，临床上可将CTCs与 CEA相结合来提高特异性。

3 CTC与大肠癌预后的关系

由于剪切应力和免疫监视等生物和物理限制，绝大多数进入循环系统的肿瘤细胞群都会死亡，小部分存活的CTCs(0.01%)却能够获得成瘤能力[17-18]，形成转移灶并重建肿瘤异质性[19]。研究表明，CTCs对非转移性和转移性CRC预后的评估均有很高的价值。在非转移性CRC中，CTCs的存在可以预测患者未来的转移和较差的疾病结局。在转移性CRC(metastatic colorectal cancer,mCRC)患者样本中鉴定出CTC可能表明转移病灶转移的重新播散[20]。临床数据表明，约20%(I期和II期)和30%(III期)的CRC患者在根治性手术后的5年内复发[21]。这些观察结果表明肿瘤细胞发生了术前或术中播散，随后导致转移形成[22]。非转移性CRC患者血液中CTCs的存在可作为已经存在的微转移的替代标志物，这些CTC具有较高的预后价值[23-24]。在CRC中使用CellSearh识别CTCs的研究表明，每7.5毫升血液中CTCs > 5的CRC患者预后更差，一年内发生转移的风险高8倍[25]。另一项使用CellSearh系统的前瞻性研究，每7.5毫升血液中CTCs > 1的CRC患者预后更差[26]。最近的一项Meta分析(包括20项研究和超过3100例患者[27])证明,CTCs是CRC的一种有价值的预后因素。值得注意的是，Rahbari等[20]研究表明，在伴有肝转移的mCRC患者肝静脉血中CTC比外周静脉血中多。CTC阳性的mCRC患者(CTC > 3/7.5 mL血液)预后更差，无进展生存期显著降低，与非转移性CRC的结果相似[28]。以上结果表明，CTC是一种预测CRC进展和不良预后的有效手段，监测治疗前后CTC有助于预测预后，判断术后复发的风险性。

4 CTC与大肠癌治疗反应的关系

CTC不仅作为诊断和预后标志物，还可用作治疗反应的生物标志物。Huang等[29]报道的一项Meta分析,发现CTC可用作预测CRC患者化疗反应的新型标志物。在mCRC的临床前试验中，CTC也可用作患者治疗反应的预测标志物[30]。现在临床上大多数CRC患者以5-氟尿嘧啶为基础进行化疗。如果肿瘤为RAS野生型，则在这些方案中常规添加靶向药物，如帕尼单抗和西妥昔单抗。然而，大多数肿瘤治疗后会产生耐药性。因此，转移性CRC的治疗决策取决于患者是否存在耐药。据推测，与单独的放射学监测相比，CTC检测可能会增加检测灵敏度及早期检测出治疗耐药性。一项研究表明，在III期CRC患者中辅助mFOLFOX后，CTC 持续阳性是一个不良预后因素[31]。综上所述，CTC可用于评估治疗反应。值得注意的是，CTCs在治疗过程中EpCam 和细胞角蛋白等上皮标记物会下调，来逃避检测。通过CellSearch系统检测，发现在接受贝伐珠单抗治疗的IV期乳腺癌患者中CTCs显著下降，实际上这些患者出现了疾病进展[32]。

5 结 语

近年的研究使CTCs在CRC患者中的临床应用取得了重大进展，现在可应用于CRC的预后、治疗反应以及肿瘤复发的检测等重要环节，CTCs作为液体活检的一种形式，在促进CRC患者实施精准医疗方面具有巨大的潜力[33]。如今CTC已被FDA批准用于CRC患者的疾病监测和预后判断。然而，CTCs检测仍然面临着重大挑战。①检测过程中需要克服CTC的罕见性和异质性。CTC检测方法众多，每种方法都有自己的样本制备、富集和分析的方案，但是仍无法完全克服这个问题。②大多数研究是小型、单中心、病例对照研究，患者人口统计学差异很大，这使得验证研究非常困难。③目前的大多数研究结果均是基于CellSearch系统，如上所述，该系统检出率低，可能漏掉了间质型或不表达EpCAM的细胞。因此我们还是需要去研发一种具有高灵敏度和高特异性的标准化检测方案，用来捕获全部的CTCs。在此基础上，进行更大样本量的多中心、前瞻性研究明确CTC在大肠癌诊疗中的价值。此外，我们还需要通过测序、体外培养等方法明确CTC的分子生物学、细胞生物学特性，为开发新的诊断及治疗靶点提供依据。