CD4+T细胞在肝癌缺血再灌注损伤中的研究进展

夏森哲，王经琳，任昊桢综述，施晓雷审校

0 引 言

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是肝脏最常见的原发恶性肿瘤，目前全球死亡率及发病率分别排第四、第六位，并且呈现逐年上升趋势[1]。肝切除术是肝癌有效治疗手段之一[2]，但是肝切除术常伴发肝缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury，IRI)，一定程度上改变肝脏微环境，影响肝功能。目前对于IRI过程已经有了较深入的研究，发现有各种因素参与此过程[3]。其中，作为适应性免疫的重要成员，CD4+T细胞不仅参与IRI，而且其免疫调节作用在肝癌中同样起到重要作用。所以探究CD4+T细胞在肝癌肝切除术引起的IRI中的变化及作用，并研究其对肝癌的影响是具有深远意义。本文主要就各类CD4+T细胞在IRI中的作用作一综述。

1 CD4+T细胞与IRI

IRI是临床肝手术过程中常需要面对的问题，在肝切除、肝移植等肝手术过程中，常会引起肝长时间的缺血。肝缺血引起供氧减少，腺嘌呤核苷三磷酸产生减少，刺激机体活性氧的产生和黏附分子表达，活性氧诱导细胞损伤、凋亡甚至坏死[4, 5]。肝IRI分子机制是复杂多样的，有各种免疫细胞参与肝缺血再灌注，肝的缺血应激引起肝窦内皮细胞和肝细胞损伤，继而释放损伤相关分子。高迁移率族蛋白B1(high-mobility group box 1，HMGB1)作为一种特征性损伤相关分子，在遭受缺血应激后能够通过正反馈系统诱导诱导肝内巨噬细胞(kupffer cells，KCs)产生TLR4依赖的TNFα[6]，并且KCs对TLR4反应受到细胞表面TIM4调节[7]。CD4+T细胞作为IRI中主要的介质，可促进KCs的激活，从而引发IRI炎症爆发，最终导致肝细胞功能紊乱。

T细胞是一类抗原特异性免疫细胞，T细胞受到不同类型的刺激，进而分化为不同表型T细胞，分泌不同细胞因子，调节炎症反应[8]。但在肝缺血再灌注中，并无明显的抗原呈现，为一种特殊的无菌性炎症[9]。CD4+T细胞是调节性免疫的至关重要的成分，能够调控CD8+T细胞和B淋巴细胞，募集炎症部位周围免疫细胞[10]。在肝切除过程中，难以避免会引起IRI，在使用强效T细胞抑制剂的条件下，如应用FK506和环孢素A[11]，或者在T细胞敲除的小鼠中，与对照组相比，缺血再灌注损伤有所缓解。CD4+T细胞上STAT4是引起IRI的必要成分，STAT4缺陷的T细胞能够缓解肝IRI，抑制TNF-a等Th1细胞促炎因子的产生，其保护机制可能依赖于血红素氧合酶过度表达[12]。CD4+T细胞根据分泌的细胞因子、转录因子和免疫作用，主要可分为Th1、Th2、Treg、Th17等细胞[13]。

2 各亚型CD4+T细胞与IRI

2.1 Th1/Th2在IRI中的作用Th1细胞作为一种经典的CD4+T细胞亚型，对其研究已较为深入，普遍被认为是一类促炎型CD4+T细胞，能够分泌促炎细胞因子，如IL-1β、TNF-α、IFN-γ等，推动CD8+T细胞激活、介导迟发性超敏反应和拮抗Th2细胞，加重炎症反应。在肝IRI中，Th1细胞表达明显增加，更长的热缺血时间推动Th1/Th2细胞因子之比向Th1细胞因子倾斜，加重炎症反应[14-15]。这些促炎因子导致免疫系统失调，引起选择素P表达上调，促进血小板黏附和激活，增加趋化因子的释放，加快中性粒细胞及巨噬细胞的募集，继而增加活性氧的产生，加重细胞组织的损伤[16]。在肿瘤患者中发现，Th1相关细胞因子，包括IL-2, TNF-α, IFN-γ，表达显著降低[17]。Th1相关促炎细胞因子，被认为能够激起机体适应性免疫，促进免疫炎症反应，具有抗肿瘤作用。IL-2作为Th1细胞因子，参与T细胞免疫反应全过程，包括初级扩张、收缩、记忆产生和二次扩张，其发挥抗肿瘤作用的原理主要基于促进抗肿瘤细胞的增殖与激活，主要是CD8+T细胞和NK细胞[18]。癌旁组织内IL-2的mRNA高表达能够显著减少肿瘤的复发，延长肝癌根治术后的生存时间，也可作为一种肝癌预后预测指标之一[19]。

Th2细胞是一类免疫抑制性CD4+T细胞，分泌抗炎细胞因子稳定炎症微环境，如IL-4, IL-5, IL-10等细胞因子，介导体液和过敏反应，下调Th1细胞活性，缓解炎症反应。在肝IRI早期，肝内Th2细胞因子表达增加，肝内Th2细胞因子的表达与血清中TNF-a表达呈负相关[20]。在肝细胞癌中，Th2细胞被认为起主导作用[21]，与正常健康个体相比，肝癌患者Th2细胞因子，包括 IL-4, IL-6,IL-10，表达明显上调，其潜在的机制可能是Th2细胞相关抑制性细胞因子，抑制抗肿瘤免疫，从而促进肿瘤细胞免疫逃逸，促进肿瘤进展[22]。IL-10作为Th2细胞因子，通过抑制巨噬细胞和淋巴细胞分泌促炎细胞因子，促进肿瘤的进展[23]。Th2细胞因子具有预测肝癌预后作用，与非转移性肝癌相比，转移性肝癌肝组织中Th2细胞因子表达显著增加，而Th1细胞因子表达下降，与HCC患者预后呈现显著负相关性[24]。

2.2Treg在IRI中的作用Treg是一类免疫抑制性淋巴细胞，Treg可通过IL-10、TGF-β等抗炎细胞因子发挥作用，对适应性免疫起到抑制作用，稳定机体免疫微环境[25-26]。Treg根据产生部位不同，可分为胸腺源性Treg(tTreg)、外周源性Treg(pTreg)、诱导型Treg(iTreg)等3种亚型，不同的亚型抑制作用的机制或存在差异[27]。

最新的研究验证Treg能够缓解缺血应激，减少免疫细胞浸润[28]。在IRI早期，由于肝炎症爆发，Treg表达受到抑制，随着再灌注时间延长至48 h后，肝逐渐开始自我修复重建，Treg表达较前上升，开始抑制肝炎症反应，推动肝修复重建[29]。Treg通过释放TGF-β抑制KCs的基质金属蛋白酶的产生，促进KCs上SMAD3的磷酸化，继而缓解IRI[29]。Treg具有一定的可塑性，在腺瘤息肉病中，内源性Treg的功能可发生改变，从原先的分泌IL-10抑制免疫转换到分泌IL-17促进炎症反应，呈现Treg向Th17转变的过程[30]。最近研究发现，存在一种Foxp3+RORγt+双阳性的中间过渡状态Th细胞，为Treg具有向Th17转分化的潜力提供证据[31]。本课题组同样也发现，在tTreg表面有丰富IL-6R表达，为tTreg向Th17转分化提供结构基础，肝遭受缺血应激后，KCs的内质网应激诱导tTreg向Th17转化，加重炎症反应[32]。

近来，Treg的免疫抑制在肿瘤中的作用备受关注，从慢性乙肝到不典型增生再到肝细胞癌，肝内浸润及外周循环中的Treg水平逐步增加，瘤内高表达的Treg与低总体生存率呈现显著负相关[33]。活化的Treg可通过免疫检查点与其配体接触依赖的方式，包括PD-1,PDL-1,TIM-3等[34]，抑制不同类型的免疫细胞，继而可能抑制有效的抗肿瘤免疫，促进肿瘤细胞免疫逃逸，从而推动肿瘤进展。在肿瘤微环境中，尤其是IRF4+Treg能够调控免疫抑制程序，与癌症患者不良预后密切相关[35]。然而，与常规认为Treg的免疫抑制作用促进肿瘤进展不同，在某些慢性炎症或炎症来源癌症中，Treg的免疫抑制作用似乎能起到保护作用，或许能成为一种慢性炎症预防癌变的治疗方式[30, 36]，干扰炎症或许是治疗慢性炎症的有效手段，但是干扰炎症是个双刃剑，由于缺乏治疗特异性，在干扰慢性炎症的同时会改变免疫微环境，抑制抗肿瘤免疫，从而促进肿瘤的发生、发展、复发。

2.3Th17在IRI中的作用Th17是一类特征表达ROR-γ转录因子的CD4+Th细胞，不同于传统Th1和Th2，其能够分泌IL-17A、IL-22等细胞因子。目前针对Th17研究，更多的研究者聚焦于Th17/Treg平衡，类似于Th1/Th2的平衡，发现各种因子调节这种平衡，如miR-21、Rab4b、Foxo1、肠道菌群等[37-41]。初始T细胞在TGF-β和IL-6存在条件下，促进ROR-γ转录因子表达，推动原始T细胞分化为Th17[42]。TGF-β介导初始T细胞分化具有浓度依赖性，在低浓度时，TGF-β与IL-6和IL-21协调促进IL-23受体表达，IL-6通过T细胞上STAT-3促进T细胞向Th17分化[43]，STAT-3增加与IL-17和IL-21的启动子结合，与ROR-γ转录因子协同增加其转录，促进Th17分化[44]；而在高浓度时，TGF-β抑制IL-23，有利于FOXP3+Treg细胞分化[45]。

在肝IRI中，Th17细胞因子明显上升，血清中IL-17A水平在再灌注后6h达到高峰，介导肝炎症损伤[32, 46]。IL-17能够刺激巨噬细胞分泌促炎因子，如IL-1β和TNF-a，同时诱导巨噬细胞NF-kB转录因子的激活[47]。在肝IRI中，PTEN介导的Akt/b-catenin/Foxo1轴，调控小鼠肝IRI固有炎症反应[48]，而Foxo1又与Th17细胞分化密切相关[39]，在肝IRI免疫炎症反应背景下，Foxo1是否参与调节Th17/Treg平衡仍需要进一步探讨。目前认为Th17具有可塑性，在不同的微环境中Th17具有能够转分化为其他Th细胞的潜力，如Th1、Treg、TFH等[49]。有研究发现，在炎症消退过程中，Th17转分化为Treg，继而助于炎症消退恢复[50]。由于Th17的特性，针对其可塑性，或许能成为炎症治疗的一个关键点，诱导Th17向免疫抑制方向极化，助于消退炎症，恢复功能，具有强大的研究应用潜力。

Th17也参与到各种肿瘤免疫反应中，如肺癌、肝癌、黑色素细胞瘤等。对临床样本的研究，分析发现肝癌患者在接受肝切除治疗前循环中的Th17水平与治疗后循环中的Th17水平均是肿瘤复发的高危因素，术前术后Th17的高表达与HCC复发有显著的相关性[51]。但是Th17的作用是复杂且具有双重性，可能在不同的肿瘤背景，在不同肿瘤炎症微环境中，Th17细胞因子发挥的作用可能不同[52]。一方面，认为Th17作为介导炎症反应的重要成分，能够募集调节抗肿瘤免疫细胞，如CD8+T细胞、B细胞等，介导抗肿瘤反应，并且Th17具有向Th1转分化潜力，产生TNF-a、IFN-γ等炎症因子起到抗肿瘤作用。Martin-Orozco等[53]团队发现过继转移Th17能够抑制肿瘤生长，而这种抗肿瘤作用，可能依赖于IFN-γ，而不是依赖于IL-17A，IFN-γ的分泌主要也基于Th17向Th1的转分化，刺激CD8+T细胞增殖，抑制肿瘤进展，而Th17本身对于肿瘤细胞没有直接杀伤作用。但是目前大多数研究者将Th17归类于促肿瘤类细胞，并逐渐将Th17/IL-17当作肿瘤治疗的靶点[54]。主要来自Th17细胞的IL-17，通过IL-6/JAK2/STAT3信号通路推动肿瘤生长、转移、侵袭，促进肿瘤血管生成[55]。Th17细胞在脂肪肝-脂肪性肝病-肝癌这进展过程中也扮演重要角色。CXCL3+Th17这类炎症性细胞群，在肝脂肪变性中堆积，加剧非酒精性脂肪性肝病发生[56]。IL-17信号通路能够诱导非酒精性脂肪性肝炎发生并向肝癌转变[57]，也能诱导酒精性肝病的肝癌发生[58]。所以Th17在肿瘤中的作用具有双重性，这种双重性可能基于Th17细胞的高度可塑性，所以正确理解深入探究Th17生物学活性，明确Th17的转分化与肿瘤炎症微环境变化之间的相关性具有深远的研究意义和临床应用意义。在肝炎症性疾病治疗中，干扰炎症可能是最直接有效的措施，但是在研究干扰炎症的过程中，还需进一步考虑炎症与HCC发生的关系，在一些干扰炎症的同时也会抑制抗肿瘤炎症反应，这都是应该在临床应用前需要考虑研究的问题。

3 结 语

肝切除是肝癌的重要治疗手段，但是肝切除引起的IRI仍然是当前亟需解决的问题。IRI的分子机制是复杂多样的，尤其是CD4+T细胞在免疫微环境中起到重要作用，不同Th细胞亚型涉及不同信号通路。不同作用的Th细胞之间存在平衡关系，也存在相互转化的潜力，正确认识不同Th细胞之间相互作用及其作用机制，介导不同Th细胞之间的平衡转化是干扰炎症反应、改善肝癌缺血再灌注损伤的新方向。