寻常型银屑病和汗孔角化症患者外周血Vγ9Vδ2 T细胞的表型分析

周嘉青 陶 璐 颜克香 栾 菁 张乔安 潘洁雯 张正华△ 沈 蕾

（1复旦大学附属华山医院皮肤科 上海 200040；2上海交通大学医学院上海市免疫学研究所 上海 200025）

寻常型银屑病（psoriasis vulgaris，PV）是一种常见的慢性炎症性皮肤病，由机体在多基因遗传背景和环境因素等作用下，出现免疫系统过度活化导致的自身炎症和自身免疫反应［1-2］。汗孔角化症（porokeratosis，PK）则是一种少见的常染色体显性遗传的角化异常性皮肤病，可由甲羟戊酸（mevalonate，MV）通路上致病基因的缺陷引起固有免疫亢进（自身炎症），进而导致角化过度，目前已被归类到自身炎症性角化病［3-5］。国内外均有PV和PK共存的病例报道［3，6-13］，PV可见于家族性或者散发PK患者。以往的基因表达谱研究支持PV和PK在分子水平上具有相似性的观点［14-15］，提示了二者在自身炎症机制中可能存在相关性。体内细胞在炎症反应或肿瘤形成过程中可出现增殖和/或活化，发生代谢重编程，促进MV通路，为合成胆固醇和甾类激素等提供重要的前体［16］。真皮IL-17+γδT（γδ17T）细胞在PV的炎症应答中发挥重要作用［17-18］，而MV通路上的多种磷酸化代谢产物是γδT细胞的强效激动剂［16］，提示MV通路有可能通过激活γδT细胞分泌炎症因子而参与PK发病。虽然大多数PK患者携带MV通路上的基因突变，但目前尚不清楚其γδT细胞的数量和功能是否存在异常。本研究通过比较PV、PK患者与正常对照（normal control，NC）的外周血Vγ9Vδ2 T细胞比例、皮肤趋化表型和分化表型的变化，为深入研究γδT细胞参与自身炎症和角化过度提供实验依据。

资料和方法

研究对象本研究经复旦大学附属华山医院伦理委员会批准（KY 2017-367）。2017年10月至2018年12月，来自皮肤科门诊的33例斑块状PV和19例PK患者，以及33例健康志愿者在获得充分说明后签署书面知情同意书。入选标准：常规检查无其他器质性病变；在1个月内均未接受系统治疗，2周内均未外用糖皮质激素、维A酸和卡泊三醇等药物。PV受试者至少由两位医师诊断为斑块状PV，其中男性18例，女性15例，年龄18～65岁，平均36.67岁；病程1～29年，平均11.67年；银屑病皮损面积和严重度指数评分（psoriasis area and severity index，PASI）为4～38.4分，平 均16.03分 。根据2018年中国银屑病诊疗指南对疾病严重程度的界定标准［19］，其中11例为中度银屑病患者（3

主要试剂和仪器APC-Cy7-抗人CD3（Clone SK 7）、BV 786-抗人CD45RA（Clone HI100）及同型对照均购自美国BD Bioscience公司；PE-抗人CLA（REA 1101）及同型对照购自德国Miltenyi Biotec公司；PE-Cy7-抗人Vδ2（Clone B6）、APC-抗人Vγ9（Clone B3）及同型对照、人Fc受体阻断剂（Human TruStain FcX™）均购自美国Biolegend公司；PECy5-抗 人CD27（Clone O323）及 同 型 对 照、Live/Dead Blue染色试剂盒均购自美国Sigma-Aldrich公司 ；Ficoll-Hypaque购 自 加 拿 大 Stemcell Technologies公司。96孔圆底培养板为美国Corning公司产品；流式细胞仪（LSRFortessa™X-20）为美国BD Bioscience公司产品；Flow Jo流式分析软件购自美国Tree Star公司。

研究方法

PBMCs分离 每例PV、PK和NC组对象取外周血10 mL肝素钠抗凝，使用Ficoll-Hypaque进行密度梯度离心常规获取外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）进行重悬，备用。

流式细胞术检测 每例标本取1×106个细胞，在100μL Live/Dead Blue（1μg/mL）溶液中室温避光孵育15 min，PBS洗涤，加入25μL受体阻断剂（浓度10μg/mL）室温避光孵育5 min，再加入25μL APC-Cy7-抗人CD3、APC-抗人Vγ9、PE-Cy7-抗人Vδ2、PE-抗人CLA、PE-Cy5-抗人CD27、BV 786-抗人CD45RA荧光标记的单克隆抗体（浓度20μg/mL），在4℃下避光孵育30 min，洗涤缓冲液洗涤后重悬，用BD LSRFortessa™X-20流式细胞仪检测上述抗体表达，用Flow Jo软件进行分析。

统计学分析数据中连续性变量用±s表示，采用GraphPad Prism V.8.0统计学软件，单因素t检验进行各组间两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

PV与PK患者的PBMCs中Vγ9Vδ2 T细胞比例均出现显著下降如图2A所示，流式细胞术圈门Vγ9Vδ2 T细胞，确定Vγ9Vδ2 T细胞占CD3+T细胞比例。结果显示，相较于NC组［（5.30±3.93）%］，PV组［（3.36±2.68）%］和PK组［（3.32±2.48）%］均显著下降（t=-2.349，P=0.0224；t=-2.226，P=0.030 6）；PV组与PK组之间差异无统计学意义（图3A）。

PV与PK患者的CLA+Vγ9Vδ2 T细胞比例均出现显著下降皮肤淋巴细胞抗原（cutaneous lymphocyte antigen，CLA）是一种皮肤淋巴细胞归巢的表面标志物。如图2B所示，流式细胞术圈门CLA+Vγ9Vδ2 T细胞，确定CLA+Vγ9Vδ2 T细胞占总Vγ9Vδ2 T细胞的比例。结果显示，相较于NC组［（23.44±14.95）%］，PV组［（12.70±11.44）%］和PK组［（13.97±8.59）%］均显著下降（t=-3.277，P=0.001 7；t=-2.901，P=0.005 5）；PV组与PK组之间差异无统计学意义（图3B）。

PV与PK患者的Vγ9Vδ2 T细胞分化表型存在相似性根据CD27和CD45RA的表达状态（图2B），Vγ9Vδ2 T细 胞 分 为 幼 稚 型（naïve T cells，TNaïve；CD45RA+CD27+）、中 央 记 忆 型（central memory T cells，TCM；CD45RA-CD27+）、效应记忆型（effector memory T cells，TEM；CD45RA-CD27-）及终末分化型（effector memory T cells expressing CD45RA，TEMRA；CD45RA+CD27-）［20］。以上4个细胞亚群在NC组的比例分别为（17.23±11.36）%、（57.39±18.17）%、（13.50±9.73）%和 （11.88±9.16）%；在PV组 中 分 别 为（35.49±13.59）%、（34.58±19.38）%、（7.04±5.59）% 和 （22.89±13.66）%；在PK组 中 分 别 为（23.43±16.11）%、（44.23±17.02）%、（10.17±10.39）%和（22.17±18.83）%。与NC相比，PV组的TCM和TEM的比例出现显著下降（t=-4.932，P<0.0001和t=-3.303，P=0.001 8），TEMRA比 例 则 显 著 升 高（t=3.849，P=0.000 3）；PK组中也出现TCM比例明显下降（t=-2.572，P=0.013 1）和TEMRA比例相应升高（t=2.236，P=0.035 3），TEM的比例与NC组相比差异无统计学意义（图3C）。

讨 论

γδT细胞是一种非传统的固有样T细胞，由前体T细胞在胸腺中发育而来，可在机体发育早期转移到皮肤和黏膜中成为组织驻留细胞，参与抵御病原体的感染和炎症反应［21-22］。γδT细胞的表面表达特异性的T细胞受体（T cell receptor，TCR），与传统的αβT细胞不同，γδT细胞无主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）的限制性，可直接识别细胞产生的内源性或细菌病毒等病原体产生的外源性小分子磷酸化抗原，快速产生IFN-γ、IL-17等细胞因子，在固有和适应性免疫应答中发挥着重要的桥梁作用［23］。外周血γδT细胞约占CD3+T细胞的5%，以Vγ9Vδ2亚型最常见。本研究结果支持Laggner等［24］的发现，即PV患者外周血中Vγ9Vδ2 T细胞和皮肤趋化表型CLA+Vγ9V 2 T细胞的比例均明显减少。此外，Laggner等［24］还发现PV皮损处Vγ9Vδ2 T细胞的比例增多，对于成功获治的PV患者，其外周血Vγ9Vδ2 T细胞的比例可恢复至正常范围。刘钧天等［25］采用实时荧光定量PCR的方法对银屑病皮损处γδT细胞TCR进行分析，发现与NC组相比，PV组皮损Vγ9的表达明显升高，PV组外周血PBMC中Vγ9的表达降低。由此可见，外周血的Vγ9Vδ2 T细胞在PV发作时可能迁移至皮损，参与皮肤的免疫应答。

依据表面分子CD27和CD45RA的不同，Vγ 9Vδ2 T细胞可分成4个具有不同功能的亚群。幼稚型TNaïve细胞经小分子磷酸化抗原的激活，可分化为中央记忆型TCM细胞，部分TCM与TNaïve细胞可归巢至次级淋巴器官储备，不参与免疫应答；另一部分TCM细胞则继续分化为效应记忆型TEM和终末分化型TEMRA细胞，主要迁移至外周组织，参与免疫应答。其中，以TEMRA的促炎和细胞毒性能力最强［20，26］。与NC组相比较，我们发现PV组Vγ9Vδ2 T细胞的分化表型中记忆型TCM和TEM的比例显著减少，终末分化型TEMRA细胞显著增多。Vγ9Vδ2 T细胞可能受到内源性和外源性磷酸化抗原的反复刺激，从记忆型TCM和TEM分化为TEMRA细胞。这些终末分化型TEMRA细胞通过分泌促炎因子来发挥炎症效应，也是结核、手足口病和细菌性脑膜炎等感染性疾病患者外周血Vγ9Vδ2 T细胞的主要表型［27-29］。

De Simone等［12］报道1例PV患者在接受光疗后，多数皮疹已消退，但是其腰部的环形斑块却持久不退，经皮肤病理最终诊断为PV伴发斑块型PK，表明这两种疾病在临床和发病机制上可能存在相关性。本研究PK组中有1名56岁男性患者，伴有PV病史40年。他在17岁时头皮先出现红斑和鳞屑，2年后，其双下肢出现鳞屑性丘疹和斑块，当时临床诊断为PV，曾口服中药和外用药物（具体不详），接受紫外光疗等。40岁时，他曾间歇肌肉注射曲炎舒松注射液近1年，停药后皮疹反复；41岁时，其面部、躯干和四肢陆续出现深褐色环形斑疹，结合皮肤病理和临床表现，诊断为浅表播散型PK。患者主诉其95岁母亲有类似PK皮疹，伴PV病史30年。与NC组相比较，PK组外周血中Vγ9Vδ2 T细胞和皮肤趋化表型CLA+Vγ9Vδ2 T细胞的比例，以及表型分化的趋势与PV组基本保持一致。记忆型TCM向炎症效应型TEMRA过度分化，是固有免疫亢进的表现，该细胞可能迁移至皮肤，参与皮肤的自身炎症应答。

本研究发现PV和PK患者的外周血Vγ9Vδ2 T细胞比例和表型具有相似性，为将来干预γδT细胞来调控皮肤自身炎症的研究提供了依据。

作者贡献声明周嘉青，陶璐 采集样本，流式细胞术实验，数据统计分析，论文撰写和修订。颜克香，栾菁，张乔安，潘洁雯 采集样本，数据分析和解释。张正华，沈蕾 研究设计，数据统计分析指导，论文撰写和修订。

利益冲突声明所有作者均声明不存在利益冲突。