水提法生产左旋多巴的工艺研究及优化*

李学坚，银江林，袁经权**，苏 健，赵小超，黎永红，黄 艳，张雯艳，张桂珍

(1.广西中医药大学科学实验中心，广西南宁 530222；2.那坡康正天然植物提取有限责任公司，广西百色 533900；3.广西壮族自治区中医药研究院，广西南宁 530022)

0 引言

左旋多巴(L-dopa)收载于世界各国药典，在帕金森综合症的临床治疗中起十分重要的作用[1]。1961年Birkmayer发现L-dopa有抗帕金森综合症作用[2]，1968年美国食品药品监督管理局(FDA)批准应用于临床，1973年上市销售，市场需求日渐增长。L-dopa的生产途径有化学合成法、生物酶催化法、生物发酵法和植物提取法。化学合成法因L-dopa和D-dopa手性拆分技术难度大，成本高，仅有欧洲、日本等发达国家采用；生物酶催化法和生物发酵法因技术不成熟，产量低，目前没有量产；植物提取法因原料丰富易得，工艺简单，逐步成为主流[3]。植物提取法最初以蚕豆荚皮、蚕豆及藜豆为原料，后多采用猫豆；工艺也从酸提-铅沉法[4]、稀醋酸法[5]发展到酸浸-离子交换法[6]。广西以其猫豆资源优势，近二十年逐渐成为世界L-dopa的主要产区[7]，生产工艺为用稀HCl水溶液浸提，浸提液上001×7(732)阳离子交换树脂柱，将L-dopa富集于柱上；交换饱和后用水洗柱，再用浓氨水将L-dopa从柱上洗脱；洗脱液用HCl中和，减压浓缩，析出粗品；粗品用稀HCl溶液加热溶解至饱和，冷却析出结晶，过滤，烘干，即得L-dopa产品[8]；用过的阳离子交换柱，须用NaOH溶液和HCl溶液再生才能用于下一次交换。在上柱、洗柱及柱再生工序有大量工艺废水产生；每生产1 kg L-dopa，可产生1.5-2.0 t高含淀粉、蛋白质、HCl和NaOH的废水，环保压力大，所有传统生产厂家因环境评价不合格而面临关停。目前国内外为解决L-dopa生产工艺排放黑臭废水的研究鲜有报道。中国学者大多着重于新技术、新手段的应用，如汪桂芳等[9]利用膜分离技术提高分离效果，杨卫华[10]采用重组酪氨酸酚裂解酶催化合成左旋多巴。波兰Polanowska等[11]为了环境保护和缩短工艺流程，尝试用0.2%醋酸水为溶剂从蚕豆中提取左旋多巴，但只是完成实验室提取试验，没有精制出产品，也没有进行工艺中试。

本研究摒弃传统工艺，创新性地开发一种新的生产工艺，虽然水的浓缩、蒸发量较大，但不产生含淀粉、蛋白质、HCl和NaOH的废水，能全面解决传统工艺的黑、臭、高COD工业废水问题，且产品得率、产品质量与传统工艺相当，可减少企业环保压力。

1 材料与方法

1.1 仪器

Alliance 2695型四元泵带紫外检测器高效液相色谱仪(Waters公司)，GM705H型破壁料理机(上海飞利浦(中国)投资有限公司)，HB43-S型水分测定仪(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)，DHG9246A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)。

1.2 材料

聚丙烯酰胺(PAM，非离子型，广州东歌化工科技有限公司)；聚合氯化铝(PAC，巩义市碧波供水材料有限公司)；HCl、NaOH和MgCl2(西陇科学股份有限公司)；甲醇(Thermo Fisher)；维生素C(VC，东营市华璇生物科技有限公司)；单宁酸(广州市德晟化工有限公司)；蒙脱石(粤江新材料(广州)有限公司)；食品级95%酒精(广西崇左东亚糖业有限公司)；含量测定用试剂为色谱纯，水为重蒸水；其余制剂为分析纯。猫豆(又名狗爪豆)，经广西中医药大学韦松基教授鉴定为豆科藜豆属狗爪豆Mucunapruriens(Linn.) DC.var.Utilis (Wall.ex Wight) Bak.ex Burck的成熟、干燥种子[12]。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

常温下用含VC水将干猫豆打成水浆，加PAM，静置沉淀(第一次沉淀)，滤取滤液；滤液加热煮沸，冷至室温，加PAM，静置沉淀(第二次沉淀)，滤取滤液，浓缩，静置析出L-dopa粗品；滤取粗品，用pH值为3.5的HCl水溶液煮沸溶解至饱和，趁热滤取滤液，冷却，结晶析出L-dopa，滤取结晶，烘干得L-dopa原料药产品。

1.3.2 供试液制备方法

1.3.2.1 含VC水的制备

常温下操作，将1 g VC加入1 000 mL水中，充分搅拌使之完全溶解；用HCl调节pH值为4.5-5.0。

1.3.2.2 PAM溶液的配制

取1 g非离子型PAM加入到1 000 mL去离子水中，快速搅拌使之全部溶解。即配即用。与料液(水浆或滤液)混合时，要快速、充分地搅拌均匀。

1.3.2.3 猫豆水浆的制备

常温下操作，将含VC水和干猫豆一起放入破壁料理机中，不加热，转速7 500 r/min打浆10 min，得混悬状水浆。

1.3.3 L-dopa含量测定

按《欧洲药典》中提及的方法[13]进行。

1.3.4 澄清效果测定

1.3.4.1 澄清效果指标

在规定料液温度下操作；先将料液与沉淀剂快速、充分地搅拌均匀，再保温静置至规定时长，一次性倒入布氏漏斗，用2层Φ11 cm中速定性滤纸在-0.1 MPa真空度下抽滤10 min，测量滤液体积(VF)。

1.3.4.2 不同沉淀剂对澄清效果的影响

60 g猫豆，打成1 800 mL水浆，分成9等份，每份200 mL，分别与不同沉淀剂(各自预先溶于5 mL水)快速混匀，静置，沉淀1 h，抽滤，测量滤液体积(VF)；取滤液测定L-dopa含量(C)。

1.3.5 基于猫豆原料的L-dopa转移率计算

L-dopa转移率T=(W产品×C产品)/(W原料×C原料)×100%，

式中：W产品为L-dopa产品质量；

C产品为L-dopa产品中L-dopa的含量；

W原料为猫豆原料的质量；

C原料为猫豆原料中L-dopa的含量。

2 结果与分析

2.1 操作温度对水浆沉淀澄清的影响

预试验结果表明，水浆温度超过65℃，无论加入何种沉淀剂，水浆均呈大粘度的稀薄液体，难以过滤。因此工艺全部在室温下操作，水浆温度22-28℃。

2.2 不同沉淀剂对水浆沉淀澄清的影响

数据表明，不添加沉淀剂的水浆难以自然沉淀；加入PAC和PAM的沉淀效果最好。添加熟石膏粉、MgCl2、明矾、蒙脱石、PAC，水浆中L-dopa含量降低，且添加明矾、蒙脱石、PAC的水浆颜色变深；其余添加沉淀剂对水浆中的L-dopa 含量没有影响(表1)。因此本工艺选用PAM作沉淀剂。

表1 不同沉淀剂对水浆沉淀效果的影响(x±s,n=3)Table 1 Effect of different precipitants on soymilk precipitation (x±s,n=3)

2.3 第一次沉淀工序的参数优选

表2 第一次沉淀工序的因素和水平Table 2 Factors and levels of the 1st precipitation process

表3 第一次沉淀工序的试验设计与结果Table 3 Test design and results of the 1st precipitation process

表4 第一次沉淀工序的方差分析Table 4 Variance analysis of the 1st precipitation process

极差分析显示，因素影响大小为A>C>B，结果提示选A3B2C3。方差分析显示，A有显著影响(P<0.01)，B、C影响不明显(P>0.05)。对数据进行单因素分析，A1→A2变化明显(P<0.05)，A2→A3变化不明显(P>0.05)，拐点在A2，因此选A3较妥；B、C因素变化拐点不明显(P>0.05)，可结合实际情况选择，越接近极差分析结果越佳。综合考虑，选择A3B2C2，即常温下操作，1 kg猫豆用35 L含VC水磨成水浆；1 L水浆加0.15 g PAM，快速、充分搅拌混合，常温静置1.5 h，即可进行过滤。

2.4 第二次沉淀工序的参数优选

采用L9(34)正交试验法。按第一次沉淀工序优化参数制备滤液，将滤液加热煮沸15-30 min，使水溶性蛋白和淀粉变性析出，冷却降温到所需温度。沉淀剂仍选用PAM，PAM在超过65℃的水中会出现分解，因此考察温度定为25-50℃。取煮沸后冷却降温的滤液9份，每份200 mL，按表5的用量和温度操作，加入PAM溶液，快速搅拌混匀，保温静置沉淀一定时间，抽滤，测量滤液体积(VF)，结果如表6，方差分析结果如表7。

表5 第二次沉淀工序的因素和水平Table 5 Factors and levels of the 2nd precipitation process

表6 第二次沉淀工序的试验设计与结果Table 6 Test design and results of the 2nd precipitation process

表7 第二次沉淀工序的方差分析Table 7 Variance analysis of the 2nd precipitation process

极差分析显示，因素的影响大小排序为A>C>B，应选A2B3C1。方差分析显示，A影响非常显著(P<0.01)，C影响显著(P<0.05)，B影响不明显(P<0.1)。对数据进行单因素分析，A1→A2变化明显(P<0.05)，A2→A3变化不显著(P>0.05)，拐点出现在A2，因此选A3较妥；B、C的变化拐点不明显(P>0.05)。综合考虑，选A3B3C1，即在室温(25℃)下操作，1 L滤液加0.1 g PAM，快速搅拌混合，静置2 h，即可进行过滤。

2.5 浓缩工序参数的优选

按第一、二次沉淀工序优化参数制备8 000 mL滤液，分为8等份，各自减压浓缩至不同体积，冷却至室温，静置6 h，滤取结晶，烘干，称重，含量测定，计算基于猫豆的L-dopa转移率，结果如表8。数据表明，当浓缩液体积是猫豆重量的2-2.5倍量时，L-dopa析出效果最好，过滤性亦佳。

表8 浓缩程度对结晶的影响Table 8 Effect of concentration degree on L-dopa crystallization

2.6 精制方法研究

沿用传统工艺的成熟精制方法[14]。往耐酸容器中加入适量pH值为3.5的盐酸水溶液(预先溶有3%的VC)，加热至沸，加入L-dopa粗品溶解至饱和，加入粗品质量4%的药用级活性炭粉，搅拌，保温40 min；趁热滤取饱和液，自然冷却至常温，析出结晶；滤取结晶，干燥后得到L-dopa产品。

2.7 工艺中试验证

将本工艺在广西那坡康正天然植物提取有限责任公司进行3批中试生产，产品按《欧洲药典》进行含量测定。结果如表9所示,工艺运行平稳，产品得率和产品质量与传统工艺相当，工艺只产生少量含HCl的工业废水。

表9 中试生产结果Table 9 Results of trial-production

3 讨论

L-dopa不溶于乙醇、石油醚、乙酸乙酯等有机溶剂；在水中微溶，常温下600 mL水可溶解1 g[15]。预试验表明，猫豆其他成分对L-dopa有增溶作用，水中溶解度可超过3 mg·mL-1，因此只要有足量的水，猫豆磨成水浆10 min，豆中的L-dopa可溶解转移入水中。L-dopa易溶于酸水，但如用pH<3.5强酸水提取，会因强酸水溶解太多杂质而导致L-dopa无法从浓缩液中析出。

本工艺的技术难点在于尽可能减少提取液中的杂质和提高产品得率。工艺采用室温下水提、煮沸凝固析出水溶性淀粉和水溶性蛋白、加PAM沉淀剂等措施，目的是最大限度地减少提取液中的杂质。猫豆皮含有大量纤维，是第一次沉淀过滤的良好助滤材料，但形成的滤渣含水率较高，带走较多提取液；两次PAM沉淀过滤，累计损失约15%提取液，相当于损失约15%的L-dopa；浓缩析出粗品工序，有15%-20%的L-dopa残留于母液，造成L-dopa的重大损失。沉淀、过滤、析出粗品工序尚有待优化以提高L-dopa转移率，最终提高产品得率。

在浓缩析出L-dopa工序的母液中尚含有少量L-dopa，可通过加入乙醇析出。工厂实际将母液直接烘干成为低含量L-dopa产品出售，既避免黑臭工艺废水的产生，又省去防爆设备购置及防爆车间建设。

酪氨酸是L-dopa产品的相关物质之一，《欧洲药典》要求其含量≤0.5%，《美国药典》要求≤0.1%[16]。长期的生产数据表明，L-dopa结晶母液的pH值越接近中性，结晶中酪氨酸含量越低。本工艺全程控制pH值为5-6，经精制，产品中的酪氨酸含量很容易达到《中国药典》和《欧洲药典》要求，部分产品可达到《美国药典》要求。

PAM能与分散于水溶液中的悬浮颗粒架桥、附着结团，有极强的絮凝、沉淀作用，广泛应用于自来水生产、食品行业废水处理等领域[17]。工艺使用PAM作沉淀剂，可确保毒性安全。猫豆水浆加热至沸时，遇到MgCl2或熟石膏，水浆中的蛋白质可凝固成豆腐状，但过滤性不佳，滤饼含水率高，L-dopa损失大，因此没有进一步研究。

本工艺不产生黑、臭、高COD工业废水，每生产1 kg L-dopa，仅产生10-20 L含HCl工艺废水。试生产结果表明本工艺绿色环保，L-dopa产品得率可接受；沉淀滤渣可用于动物饲料或生产淀粉、蛋白质产品，猫豆资源可全部利用。浓缩工序的水蒸发量很大，将在后续研究中引进膜分离技术去除大部分水后再进行浓缩。此外，与猫豆同属的蚕豆，其叶、花、幼果、成熟种子和根中的L-dopa含量均很高，尤以鲜叶(22.4 mg·g-1)为最[18]；作者后续研究将以叶、花、幼果和根为生产原料进行试验，探究新工艺的通用性和可行性。

4 结论

本研究开发的新生产工艺解决了传统工艺的黑、臭、高COD工业废水污染问题，且产品得率和产品质量与传统工艺相当，适合于工业化规模生产。