桃红四物汤联合诱导膜治疗大鼠骨缺损

欧阳崇志， 郑晓辉， 张严， 杨锐敏， 吴文正， 周琦石

（1.广州中医药大学第一附属医院，广东广州 510405；2.广州中医药大学，广东广州 510405）

肿瘤切除、骨髓炎或创伤导致的大段骨缺损的治疗给外科医生和患者提出了巨大的挑战[1]。大段骨缺损有不同的手术选择，如自体骨移植、牵张成骨或带血管骨移植，但这些技术都有其局限性，如供体部位的骨量受限和供体部位的并发症如长期疼痛等[2]。作为目前填充大骨缺损方法的一种替代方法——Masquelet 技术是有前景的临床疗法，Masquelet 技术的诱导膜组织学性质类似于滑膜组织，为骨愈合提供了有利的环境，有助于丰富的血管生成，抑制软组织侵入骨缺损，可保护自体骨移植物不被吸收。活血祛瘀法作为中医骨伤科三期辨证思想指导下的治疗方法，在骨损伤早中期调控局部炎症、促进新骨形成方面疗效确切；而桃红四物汤作为活血祛瘀法的代表方在临床广泛运用于骨折等损伤早中期治疗中，并具有较好的临床疗效。本研究旨在探讨诱导膜技术结合桃红四物汤对大鼠骨缺损的修复作用，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 SPF 级SD 雄性大鼠30 只，体质量240～280 g，购自广州中医药大学实验动物中心，许可证号：SYXK（粤）2017-0179。大鼠饲养于广州中医药大学SPF级实验动物中心。实验获得广州中医药大学动物实验伦理委员会批准，批准号：20181101006。将30 只SD 大鼠按照随机数字表分成3 组，即诱导膜+桃红四物汤组、诱导膜组、对照组，每组10只。

1.2 主要试剂与仪器 苏木素-伊红（HE）液（美国Sigma 公司）；逆转录酶（RevertAidTMReverse Transcriptase，美国Thermo 公司）；RNA 提取试剂盒、SYBR Green Realtime PCR Master Mix（日本TAKARA公司）。不锈钢内固定钢板、直径1.5 mm的自攻螺钉（东莞市横沥燎原模具加工店）；CFX96 Touch Deep Well 定量PCR 仪（美国Bio-Rad公司）。

1.3 实验药物及制备 依据《医宗金鉴》，桃红四物汤组成：桃仁10 g、红花5 g、川芎10 g、当归12 g、生地黄12g、赤芍10 g。以上中药材饮片购自广州中医药大学第一附属医院。制备方法：将上述饮片置于砂锅容器中，加入800～1 000 mL水浸泡30 min后再煎煮30 min，过滤药渣后留存药液；再加入400～600 mL水煎煮药渣30 min过滤后留存药液。将2次煎煮的药液混合后浓缩成生药浓度为1 g/mL的中药液，放入4 ℃冰箱中备用。

1.4 大鼠骨缺损诱导膜模型建立 一期手术：术前禁食8 h，术前使用4 万单位青霉素肌肉注射，采用30 g/L戊巴比妥钠（1.5 mL/kg）腹腔注射进行麻醉。麻醉效果满意后将大鼠侧卧于手术台，右下肢备皮消毒铺无菌洞巾后，在股骨外侧的皮肤和浅筋膜上做一个纵向切口。将阔筋膜张肌、股二头肌和股外侧肌分离牵开，自股骨大转子至股骨髁显露股骨外侧面，在大鼠的股骨外侧放置一块长为6孔的不锈钢钢板，在钢板的远近端分别拧入2枚普通螺钉固定，在股骨干及钢板中心用线锯进行股骨截骨，截取骨块的长度为4 mm。除对照组以外，其余2组在骨缺损区域植入长度为4 mm的骨水泥填充，使用生理盐水冲洗术区后分层缝合手术切口。

二期手术：一期手术后常规饲料喂养4 周，4 周后行二期手术。术前准备及手术入路及麻醉方法同第一期手术。诱导膜+桃红四物组和诱导膜组均截取大鼠尾骨，并清除周围软组织及软骨，制作成备用骨粒。常规消毒铺巾，沿股骨长轴纵向切开诱导膜，取出诱导膜内的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）的骨水泥。除外对照组，其余各组将自体骨骨粒植入骨缺损区，将诱导膜包绕植骨粒，缝合固定诱导膜，避免骨粒移位，使用生理盐水冲洗术区，依次逐层缝合深筋膜、浅筋膜、皮肤。对照组截骨后维持常规喂养，不做植骨处理。术后1、24、48 h 所有大鼠肌肉注射4 万单位青霉素。

1.5 药物干预 诱导膜+桃红四物汤组植骨术后第2 天开始使用桃红四物汤5.9 g·kg-1·d-1灌胃处理，诱导膜组和对照组术后第2 天则采用与诱导膜+桃红四物汤组中灌胃药液等体积的生理盐水灌胃。疗程8周。

1.6 观察指标与方法

1.5.1 X射线影像学检查 植骨术后第12周使用戊巴比妥钠麻醉大鼠，行X 射线摄片检查，以评估骨缺损区的成骨效果。按Lane-Sandhu X射线评分标准[3-4]从骨组织形成、骨连接、骨组织塑形3个方面评估骨的重建情况。Lane-Sandhu X 射线评分标准见表1。

表1 Lane-Sandhu X 射线评分标准Table 1 Criteria for Lane-Sandhu X-ray scoring

1.6.2 HE染色法观察骨缺损区域组织病理形态 二期植骨手术后第12 周获取股骨标本后常规固定脱钙，石蜡包埋后4 μm 连续切片，经HE 染色制作切片，观察骨缺损组织愈合和骨修复效果。

1. 6. 3 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（RTPCR）法检测缺损区骨组织成骨相关基因表达 在植骨手术后第12 周获取标本后，采用TRIzol法提取植骨区域的骨组织总RNA，内参基因为β-actin，检测标本中转化生长因子β2（TGF-β2）、血管内皮生长因子（VEGF）以及骨形态发生蛋白2（BMP-2）mRNA表达。所用引物由生工生物工程有限公司提供。BMP-2 引物上游序列为5’-CTGCGGTCTCCT AAAGGTCG-3’，下游序列为5’- ACTCAAACTC GCTGAGGACG-3’，扩增长度183 bp；TGF-β2引物上游序列为5’- GACCGCAACAACGCAATCTA-3’，下游序列为5’-CGTGTTGCTCCACAGTTGAC-3’，扩增长度160 bp；VEGF 引物上游序列为5’-TCGGTTCCAGAAGGGAGAG-3’，下游序列为5’-CCTGGGACCACTTGGCAT-3’，扩增长度190 bp；β-actin 引物上游序列为5’-GATCAAGATCATTGC TCCTCCTG-3’，下游序列为5’-AGGGTGTAAAA CGCAGCTCA-3’，扩增长度183 bp。PCR扩增条件：95 ℃10 min预变性；95 ℃5 s变性；60 ℃1 min退火，40 个循环。取组织总RNA 2 ng 按Thermo Scientific 公司的逆转录说明将其反转录为cDNA，并将其做10倍稀释，以β-actin为内参基因，取等量cDNA（2 ng）进行染料法RT-PCR 反应。数据统计时以目的基因与内参基因的比值为目的基因的相对定量值。

1.7 统计方法 采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 实验组1 只雄性大鼠在二期手术麻醉后死亡，考虑为麻醉药物过量导致死亡，其余29只雄性大鼠耐受手术操作，无其他并发症。

2.2 各组大鼠股骨正侧位X 片结果比较 通过大鼠股骨的正侧位X片结果可见：诱导膜+桃红四物汤组形成连续骨痂并形成髓腔，骨皮质修复较好；诱导膜组髓腔未完全形成，且重建皮质薄弱，尚可见不连续的骨皮质；对照组骨缺损区未形成骨连接，骨端硬化，髓腔闭塞。诱导膜+桃红四物汤组Lane-Sandhu X 射线评分优于其他2 组。见表2、图1。

图1 各组大鼠骨缺损区X线摄片检查结果比较Figure 1 Comparison of X-ray results of bone defect area in varoius groups

表2 各组大鼠术后股骨骨缺损区Lane-Sandhu X射线评分比较Table 2 Comparison of Lane-Sandhu X-ray scores of femoral bone defect in various groups after surgery（±s）

表2 各组大鼠术后股骨骨缺损区Lane-Sandhu X射线评分比较Table 2 Comparison of Lane-Sandhu X-ray scores of femoral bone defect in various groups after surgery（±s）

①P ＜0.001，与对照组比较；②P ＜0.001，与诱导膜组比较

Lane-Sandhu X射线评分（分）7.44±1.01①②4.80±1.03①1.50±1.18组别诱导膜+桃红四物汤组诱导膜组对照组

2.3 各组大鼠骨缺损区域组织形态比较 通过对骨缺损区域组织切片HE 染色观察，可见：诱导膜+桃红四物汤组骨缺损植骨区与正常骨组织交界处可见骨组织形成，成骨细胞排列整齐有序，较多骨小梁形成，成骨质量好；诱导膜组骨小梁形成量较少，见少量骨组织形成；对照组纤维、肌肉、结缔组织为主，骨小梁生成少，且间隙内可见纤维组织及软组织。见图2。

图2 各组大鼠骨缺损区域组织形态比较（HE染色，×400）Figure 2 Comparison of tissue morphology of bone defect area in rats of varoius groups（by HE staining，×400）

2.4 各组大鼠骨缺损区骨组织成骨相关基因表达比较 PCR结果显示，与对照组比较，诱导膜+桃红四物汤组和诱导膜组VEGF、BMP-2、TGF-β1的mRNA 表达水平存在不同程度的上调（P＜0.01或P＜0.001），其中，诱导膜+桃红四物汤组上调更为明显，且优于诱导膜组（P＜0.001）。见表3。

表3 各组大鼠骨缺损区骨组织成骨相关基因表达比较Table 3 Comparison of the expression of osteogenic related genes in bone defects in varoius groups（±s）

表3 各组大鼠骨缺损区骨组织成骨相关基因表达比较Table 3 Comparison of the expression of osteogenic related genes in bone defects in varoius groups（±s）

①P ＜0.01，②P ＜0.001，与对照组比较；③P ＜0.001，与诱导膜组比较

TGF-β1 2.10±0.08②③0.84±0.03①0.70±0.04组别诱导膜+桃红四物汤组诱导膜组对照组BMP2 1.61±0.09②③0.81±0.05②0.47±0.05 VEGF 1.96±0.07②③1.06±0.05②0.61±0.02

3 讨论

早期研究表明，聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）诱导的膜被认为是一种有前景的血管化骨再生的治疗策略[1]。采用PMMA 骨水泥填充骨缺损后，PMMA 周围逐渐形成一层含有新血管的膜[5]。去除PMMA后，通过在诱导的软组织鞘内植骨，可以快速重建缺损。诱导膜的形成是由异物引起的慢性炎症反应引起的，诱导膜可防止移植物吸收，为血管形成和皮质化创造良好的微环境，促进骨形成[2，6]。诱导膜含有血管生成和成骨相关的生长因子，如VEGF-A、BMP-2、TGF-β1[7]。VEGF 能诱导血管生成，在骨修复和骨再生中起重要作用，此外，血管可以提供营养和氧气，并通过吸引内皮细胞和破骨细胞以及刺激成骨细胞分化在骨重塑的调节中发挥重要作用。BMP-2 可以促进骨髓间充质干细胞的化学趋势、聚集、分化，直接介导骨髓间充质干细胞和未成熟成骨细胞的成骨分化。TGF-β1能促进骨髓间充质干细胞的增殖和分化，帮助合成细胞外基质蛋白，调节免疫功能[8]。TGFβ1 已被证明在异物包裹中起重要作用，因此，TGF-β1 被认为是破骨细胞-成骨细胞相互作用的假定调节因子，并在诱导膜中连续合成[1]。

根据中医骨折三期辨证施治理论，骨折早中期运用活血化瘀法可以行气活血，祛瘀通络，以调节患者机体的功能和体质，从而调控骨折局部的新陈代谢。活血祛瘀中药可调控血管内皮细胞分泌的促血管新生因子，促进内皮细胞增殖、迁移，加速血管新生[9]。既往研究[10]表明，桃红四物汤可有效减轻患者骨折相关的临床症状，改善血液流变学，促进骨折端的愈合。也有研究表明，桃红四物汤能增加血清中MMP-2 的含量，提升血管密度，具有促血管新生作用[11]。桃红四物汤能促进断端骨痂组织内VEGF蛋白表达及增加全身血清VEGF浓度，到达表达峰值呈缓慢下降，在骨折端局部维持高表达，促进断端早期骨痂血管新生，加速血肿吸收和骨痂生长，促进骨痂后期微血管改建及骨痂塑形，进而改善骨折端的愈合速度[12]。此外，李盼祥等[13]已发现，桃红四物汤可以上调VEGF、BMP-2、TGF-β1 水平，进而促进骨折愈合。

目前，较多研究表明，桃红四物汤和诱导膜都对骨形成具有较好的促进作用，但桃红四物汤在诱导膜治疗骨缺损二期植骨后联合运用的研究较少。本研究选用的动物模型是4 mm 骨缺损模型，构建Masquelet 技术二期植骨治疗模型后采用桃红四物汤灌胃干预，观察骨缺损区域的成骨效能并检测成骨相关因子。初步实验结果表明，诱导膜技术能有效改善大鼠骨缺损部位成骨，促进骨损伤区骨痂形成及改建，与桃红四物汤联合使用对骨缺损区域的成骨效能有更好的促进作用；同时，本研究中发现诱导膜联合桃红四物汤组的VEGF、TGF-β1、BMP-2 表达水平较其他2 组升高。

综上所述，桃红四物汤可能通过调控诱导膜内VEGF、TGF-β1、BMP-2 的表达，进而促进诱导膜二期植骨后骨修复的作用。该结果对提升诱导膜二期植骨后的生物学效应做出了初步的探索，基于此，本研究下一步拟对桃红四物汤调控诱导膜二期植骨后成骨及血管化的机制进行深入的探索。