RP-HPLC-UV法测定半夏泻心汤物质基准中黄芩苷的含量*

2021-12-03闫丽莉宋小雪陈忠新张文娓

化学工程师 2021年11期

闫丽莉，宋小雪，陈忠新，张文娓，田明

（黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040）

经典名方是中医药上千年沉淀的瑰宝，经历后代的传承使用证明确有很好的临床疗效，且应用广泛，使用安全，因此，古代经典名方的开发利用成为我辈中医药人的研究之重[1]。半夏泻心汤出自于东汉时期著名医师大家张仲景的《伤寒论》，也是国家下发的首批100个经典名方目录之一，该方在古代书籍中记载颇多，现代应用十分广泛、疗效确切，在治疗急慢性胃肠炎方面有很好的疗效[2-4]，本文确定半夏泻心汤物质基准中黄芩苷含量的测定方法，为经典名方半夏泻心汤中有效物质的传递关系及后续新制剂的研发奠定基础[5，6]。

1 实验部分

1.1 仪器

Thermo-Sciencetific Ultimate3000高效液相色谱仪（Thermo公司）；FA2004电子分析天平（力辰科技有限公司）；MP5200H超声波清洗机（陕西鹏展科技有限公司）。

1.2 试剂和药材

甲醇（色谱纯中国Dikma公司）；纯化水；H3PO4（AR天津市耀华化学试剂有限责任公司）。

110715-201720黄芩苷（中国药品生物制品检定所）；半夏泻心汤物质基准（自制）。

1.3 实验方法

1.3.1 色谱条件的确定色谱柱选用反向C18柱，流动相0.22%磷酸水和甲醇（53∶47），流速1mL·min-1，检测波长280nm[7]。

1.3.2 对照品溶液的制备取黄芩苷对照品适量，精密称定，置于洁净干燥的10mL容量瓶中，加甲醇制成每1mL含有0.13mg的溶液，即得。

2 结果与讨论

2.1 供试品提取方法的考察

2.1.1 提取方法的考察与结果分析精密称取半夏泻心汤物质基准0.3g，共3份，分别置于干燥的100mL具塞锥形瓶中，精密量取甲醇50mL加入其中，密塞，置于超声清洗机中，分别超声处理10、20、30min后取出，摇匀，定量滤纸滤过，蒸干，将残渣用少量甲醇溶解，转移并定容至50mL容量瓶中，即得。结果见表1。

表1 供试品提取方法结果Tab.1 Result of extraction methods of samples

由表1可知，当超声时间范围在10～30min内，各提取时间结果RSD值为1.67%（＜3%），表明黄芩苷的含量在3个提取时间内差异不明显，为确保将物质基准中黄芩苷的含量提取完全，故将超声提取时间定为20min。

2.1.2 供试品提取方法的确定精密称取半夏泻心汤物质基准0.3g，置于干燥洁净的100mL具塞锥形瓶中，精密量取甲醇50mL，密塞，置于超声清洗机中，超声处理20min，取出，摇匀，定量滤纸滤过，蒸干，将残渣用少量甲醇溶解，转移并定容至50mL容量瓶中，即得。

2.2 专属性试验

2.2.1 供试品溶液制备同2.1.2项下处理方法

2.2.2 对照品溶液制备同1.3.2项下对照品制备方法

2.2.3 阴性对照溶液制备称取处方中除黄芩外的药材（共计74g），按实验前期半夏泻心汤物质基准确定的最佳制备工艺，制备出缺黄芩的物质基准，按

2.2.3项下方法制备黄芩阴性对照溶液。

2.2.4 试验方法将2.2.1、2.2.2、2.2.3项下的溶液分别用0.45μm有机微孔滤膜滤过至液相小瓶中，放置于高效液相色谱仪中，设置每次自动进样10μL，依照1.3.1色谱条件测定，测定并记录峰面积，专属性考察结果见表2，液相色谱图见图1。

表2 专属性考察结果Tab.2 Result of specificity investigations

图1 液相色谱图Fig.1 Liquid chromatogram

由表2、图1可知，黄芩苷的出峰时间约为10min左右，峰形良好且相近保留时间内无其它杂质峰干扰，表明该黄芩苷测定方法准确有效。

2.3 标准曲线的制备及线性范围的确定

取2.2.2项下黄芩苷对照品溶液适量，经0.45μm有机微孔滤膜滤过至液相小瓶中，放置于高效液相色谱仪中，按照表3所示体积分别进样，分别记录峰面积，结果见表3，线性图见图2。

表3 黄芩苷线性关系考察表Tab.3 Investigation Table of Linear Relations of Baicalin

图2 黄芩苷标准品线性图Fig.2 Linear diagram of standard Baicalin

由表3、图2可知，将含量及峰面积为横纵坐标进行线性回归，结果表明，黄芩苷含量在0.26～1.56μg之间线性关系良好，得回归方程为∶Y=60.999X-1.3235，R2=0.9998。

2.4 精密度试验

取半夏泻心汤物质基准0.3g，精密称定，按照2.2.1项下的方法制备供试品溶液，设置每次自动进样10μL，连续进样6次，记录6次黄芩苷峰面积，计算RSD值。结果见表4。

表4 精密度试验结果Tab.4 Precision test results

由表4可知，精密度6次进样RSD值为0.74%（RSD＜3%），表明本台高效液相色谱仪精密度良好。

2.5 重复性试验

精密称取半夏泻心汤物质基准各0.3g，共6份，按2.2.1项下方法处理得到供试品溶液，分别用0.45μm有机微孔滤膜滤过至液相小瓶中，放置于高效液相色谱仪中，设置每次自动进样10μL，依照1.3.1色谱条件测定其含量及RSD值，结果见表5。

表5 黄芩苷重复性试验结果Tab.5 Repeatability test results of Baicalin

由表5可知，重复性测定6批样品含量RSD值为1.05%（RSD＜5%），表明此测定方法重复性良好。

2.6 稳定性试验

精密称取半夏泻心汤物质基准0.3g，按2.2.1项下方法处理得到供试品溶液，分别用0.45μm有机微孔滤膜滤过至液相小瓶中，放置于高效液相色谱仪中，设置序列及仪器方法，每间隔2h自动进样10μL，连续监测12h内黄芩苷含量情况，计算RSD值。结果见表6。

表6 黄芩苷稳定性试验结果Tab.6 Stability test results of Baicalin

由表6可知，12h内，所测定黄芩苷含量较稳定，RSD值为0.51%（＜3%），说明此处理方法得到的供试品溶液在12h内测定均稳定。

2.7 加样回收试验

精密称取半夏泻心汤物质基准各0.15g，共6份，分别加入提前配制完成的2.3mg·mL-1的黄芩苷对照品溶液1mL，按2.2.1项下方法处理得到供试品溶液，分别用0.45μm有机微孔滤膜滤过至液相小瓶中，放置于高效液相色谱仪中，设置每次自动进样10μL，依照1.3.1色谱条件测定，测定回收率及RSD值，结果见表7。

表7 黄芩苷加样回收试验结果Tab.7 Test result of Baicalin sampling recovery

由表7可知，6批次的供试品回收率均在95%～105%之间，表明供试品处理方法加样回收率符合要求，准确稳定。

2.8 15批样品含量测定

精密称取15批次半夏泻心汤物质基准各0.3g，按2.2.1项下方法处理得到供试品溶液，分别用0.45μm有机微孔滤膜滤过至液相小瓶中，放置于高效液相色谱仪中，设置每次自动进样10μL，依照1.3.1色谱条件测定，测定其含量及RSD值，结果见表8。

表8 15批样品含量测定结果Tab.8 Content determination result of 15 batches of samples

由表8可知，15批次物质基准所测得黄芩苷每剂含量范围在389.84～482.35mg之间，波动原因可能是由于不同批次和产地之间药材含量不同，考虑到不同因素的影响，最终确定半夏泻心汤物质基准黄芩苷含量为309.23～574.28mg·剂-1，此结果的确定也符合《古代经典名方中药复方制剂及其物质基准的申报资料要求》的要求（含量测定的波动范围一般不超过均值的70%～130%，合理确定质量标准中相关质控项目质量要求上下限）。