水牛瘦素基因的真核表达及生物学特性分析

李恭贺，陈秋玉，吴文德，郑喜邦

（广西大学动物科技学院，广西南宁 530004）

瘦素（Leptin）是一种主要由白色脂肪组织合成和分泌的肽类激素，在血浆中循环，与身体脂肪的分化密切相关[1]，主要作用是调节大脑对食物的摄入和新陈代谢[2‑3]。近年来，肥胖症和2 型糖尿病患病人群逐步上升，Leptin 在能量平衡中的生理作用引起了人们的关注[4]。正常状况下机体血液中的Leptin 量与脂肪组织量呈正比[5]，是一种内在的平衡。当Leptin缺乏时，动物就会出现多食、血糖升高及肥胖等症状[6‑7]；相反，当Leptin 增多时，动物食欲下降，能量消耗增加[8]。奶牛的繁殖性能与leptin基因表达水平密切相关[9]，过高或过低水平的Leptin均对生殖产生不利影响，外源性Leptin 也会损害小鼠的血睾丸屏障完整性[10]。

广西是我国饲养水牛最多的省份之一，多数属于沼泽型。水牛体质强健，适应性强，但是繁殖力较低，水牛奶产量远不及黑白花牛。PANDA 等[11]研究发现，在体外添加Leptin 可提高水牛卵母细胞和胚胎的发育能力，也有学者证明精子Leptin 与精子异常呈正相关，与精子浓度呈负相关[12]。CLEMENT[13]报道，Leptin 受体可在大脑的多个区域表达，其主要作用部位是下丘脑弓状核，产生激素来控制生殖内分泌系统。目前，有关leptin基因的研究多集中在人和啮齿类动物，而Leptin 参与调控水牛生殖和能量代谢方面的研究鲜见报道。为此，研究水牛leptin基因的表达及其融合蛋白的生物学活性，为进一步了解leptin基因功能及生产转基因动物奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

质粒提取试剂盒（Endo-Free Plasmid Midi Kit）购自Omega 公司；反转录试剂盒、内切酶Hind Ⅲ和BamH Ⅰ购自Fermentas 公司；引物合成及DNA 测序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成；脂质体2000 购自Invitrogen 公司，DMEM 和胎牛血清为均Gibco 产品，Leptin 多克隆抗体（ab16227）和内参β-actin多克隆抗体（ab8227）购自Abcam公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 购自北京天根生物科技公司；羊抗牛Leptin 酶联免疫测定试剂由美国Adlitteram Diagnostic Laboratories 提供；感受态细胞DH5α、载体pMD18-T-leptin和pEGFP-N1 均由广西大学兽医临床实验室克隆和保存。

1.2 引物设计和PCR扩增

根据广西大学兽医临床实验室已经克隆的水牛leptin基因序列及pEGFP-N1载体的结构特点，分别引入内切酶Hind Ⅲ、BamH Ⅰ和保护碱基，引物序列为lep-up：5′-CCCAAGCTTGCCATGCGCTGTG‑GACCCCTGTAC-3′；lep-down：5′-CGCGGATCCC‑GGCACCCGGGACTGAGGTCC-3′。PCR 反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30个循环；72 ℃延伸5 min。

1.3 表达载体的构建及鉴定

纯化leptin基因的PCR 产物，与载体pEGFP-N1经Hind Ⅲ和BamH Ⅰ分别双酶切，将胶回收的目的片断与线性化的pEGFP-N1 载体，用T4 DNA 连接酶在PCR 仪上22 ℃连接1 h。然后将产物转化DH5α 感受态细胞，挑取阳性单一菌落进行扩菌，提取质粒进行酶切和测序验证。

1.4 重组质粒EGFP-leptin在NIH/3T3细胞中表达

将鉴定正确的重组质粒EGFP-leptin再次转化DH5α 感受态细胞，挑取LB 培养基上生长的阳性菌落进行扩菌，37 ℃条件下摇菌16 h 左右，取10 mL培养的菌液进行无内毒素化提取质粒（按Endo-Free Plasmid Midi Kit 说明书进行），紫外分光光度计检测浓度。当培养的NIH/3T3 细胞汇合达70%左右时，利用脂质体2000 将EGFP-leptin转染至NIH/3T3 细胞，同时设空白细胞作阴性对照，转染24～48 h后，用荧光显微镜观察并记录。

1.5 稳定转染的细胞株筛选

待瞬时转染6 h 后，更换培养液为10%胎牛血清培养液（含双抗）。继续培养48 h 后，移去培养液，用生理盐水清洗后经胰酶消化并扩大传代培养24 h，加入0.4 g/L 的G418 进行筛选。间隔3 d 换一次培养液，连续筛选3～5 周，直至发现阳性细胞克隆，再将单个细胞克隆斑转至24 孔培养板，这时将G418 质量浓度减半（0.2 g/L），继续对阳性细胞筛选，直至获得稳定表达EGFP-leptin的细胞株。

1.6 转染细胞的检测

1.6.1 RT-PCR 检测 将24 孔培养皿中克隆斑细胞移去培养液，加入裂解液2 mL，提取细胞总RNA，反转录具体步骤根据反转录快速提取试剂盒（北京博迈德科技发展有限公司）说明书操作。leptin基因PCR反应体系如1.2所述。

1.6.2 Western blot 检测 稳定转染的细胞和未转染细胞分别用PBS 洗净，加入裂解液，反复冻融3次，4 ℃条件下12 000 r/min离心5 min，吸取上清液于1.5 mL 离心管中。然后在12% 聚丙烯酰胺凝胶中点样，进行SDS-PAGE 电泳，利用半干转印仪（恒压40 V，2 h）将蛋白质转移到PVDF 膜上，经TBST洗膜，常温下5%脱脂奶粉封闭1 h，1∶1 000 稀释的Leptin 多克隆抗体4 ℃孵育2 h，充分洗涤后，再用1∶2 000 稀释的羊抗兔IgG 室温孵育1 h，洗涤3 遍，加入显色试剂3 min，暗室曝光、显影。同时设内参β-actin作为对照。

1.7 动物试验

雌性昆明小鼠（购自广西中医药大学实验动物中心）65～70日龄18只，随机分为3组（6只/组）：对照组，自由采食，试验当天从尾静脉注射100 μL生理盐水；处理组，自由采食，试验当天从尾静脉注射重组质粒与生理盐水混合物100 μL（重组质粒1 μg/只）；禁食组，连续禁食3 d，试验当天从尾静脉注射100 μL 生理盐水。试验过程中所有分组小鼠均可自由饮水，在试验第3天称其体质量，并采取断头采血的方法处死。

1.8 ELISA法检测血清Leptin含量

各个分组小鼠血清Leptin水平用竞争性抑制法ELISA 测定。根据试剂盒说明书步骤进行操作，在酶标仪上450 nm波长处读取OD值。

1.9 数据处理

试验结果用平均值±标准差表示，利用GraphPad Prism 9.0软件作图并分析。

2 结果与分析

2.1 重组质粒EGFP-leptin的构建

leptin基因PCR 产物和pEGFP-N1 载体分别经过Hind Ⅲ、BamH Ⅰ双酶切，并进行胶回收纯化，得到约500 bp 和4.7 kb 的目的片段（图1A 和1B），再用T4 连接酶连接，并转化至DH5α 感受态细胞。扩菌16 h 后，提取质粒，进行双酶切鉴定，结果与预期相符（图1C）。最后将测序鉴定正确的重组质粒命名为EGFP-leptin。

图1 重组质粒EGFP-leptin的构建Fig.1 Construction of recombinant plasmid EGFP-leptin

2.2 EGFP-leptin质粒转染及阳性克隆筛选

待细胞转染24 h后在荧光（490 nm）显微镜下观察，如图2A所示，有少量绿色荧光出现，48 h再次观察，绿色荧光达到15%～20%（图2B），对照组（图2E）一直未发现有绿色荧光。在转染10 d 时观察，发现1个绿色细胞克隆斑（图2C），继续用G418筛选20 d时，观察到亮度增强的细胞克隆斑（图2D）。用胰酶消化阳性克隆斑，再进行传代扩大培养。

2.3 EGFP-Leptin 融合蛋白的RT-PCR 与Western blot检测

为进一步确定leptin是否在NIH/3T3 细胞中表达，将稳定转染的细胞经RT-PCR 检测，结果（图3A）显示转染组出现约500 bp 的单一条带，对照组未出现条带，与预期结果相符。

将稳定转染的细胞株裂解后，提取其总蛋白质，利用Leptin 抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 抗体检测EGFP-Leptin 融合蛋白的表达。结果显示，重组质粒转染组样品出现约47 ku 清晰特异性条带（图3B），与预期EGFP-Leptin 融合蛋白大小一致，而阴性对照（图3B）组未出现反应条带，转染组和对照组均有β-actin表达。说明leptin基因在NIH/3T3细胞中成功表达。

图3 EGFP-Leptin融合蛋白表达鉴定Fig.3 Identification of fusion protein EGFP-Leptin

2.4 融合蛋白EGFP-Leptin的生物学特性检测

由图4A 可以看出，对照组、处理组和禁食组小鼠体质量平均变化率分别为0.016%、-0.33%和-0.29%，处理组和禁食组小鼠体质量变化率与对照组差异均显著（P<0.05）。由图4B 可知，对照组、处理组和禁食组小鼠血清Leptin 含量分别为11.05 μg/L、15.12 μg/L 和11.55 μg/L，处理组与禁食组小鼠血清Leptin 水平差异不显著，但与对照组相比显著升高，说明EGFP-Leptin 融合蛋白在小鼠体内活性很强，发挥了重要调控作用。

图4 融合蛋白EGFP-Leptin的生物学特性Fig.4 Biological characteristics of fusion protein EGFP-Leptin

3 结论与讨论

MERCATI 等[14]研究发现，小鼠Leptin 由167 个氨基酸组成，N 末端包含21 个氨基酸组成的分泌信号序列，与水牛Leptin 结构相似。leptin基因的转录和翻译主要发生在脂肪组织，其他组织也发现有表达如胃、骨骼肌、脑垂体、乳房组织、胎盘和皮肤[15‑16]等。在动物血液循环中Leptin移位去除信号肽形成短链，以自由流通方式或以捆绑蛋白质的形式出现，这些特点主要由种属特异性或生理状况的不同产生[16‑17]。

利用鸡的生物反应器可使人leptin基因在NIH/3T3 细胞成功表达[17]；ZHANG 等[18]构建的小鼠GFP-leptin重组质粒在小鼠脂肪细胞中也得到成功表达。庞礴等[19]构建高原鼠兔leptin特异表达载体pBC1-lep，利用质粒脂质体法转染奶山羊乳腺上皮细胞并筛选，仅有5%的转染效率，经过实时定量PCR检测有leptin基因的表达，但未见筛选出稳定表达的阳性细胞。周朋君等[20]构建leptin基因原核表达载体pET-28a-leptin，在E.coliBL21(DE3)中实现高效表达。本研究将水牛leptin基因插入到pEGFP-N1 中，构建真核表达载体EGFP-leptin，将其转染NIH/3T3 细胞得到成功表达，并且经过G418药物的筛选，获得稳定表达leptin基因的细胞株。在试验过程中发现，细胞汇合度在50%～70%时瞬时转染效率要优于80%～90%的转染效率。构建的重组质粒经去内毒素纯化，质量浓度为1.124 g/L，转染24～48 h 内，报告基因产物的浓度（根据荧光强弱判断）逐渐增加。经G418 筛选10 d 左右发现第1个细胞克隆斑，针对细胞克隆进行传代筛选，最终获得稳定转染的细胞株。

本研究采用RT-PCR 的方法对稳定表达的NIH/3T3 细胞进行检测，证实构建的载体EGFPleptin转染NIH/3T3 细胞，有外源基因的表达。进一步Western blot 检测发现，有单一特异条带，从分子水平上证实了水牛leptin基因在NIH/3T3 细胞中成功表达。随后把稳定转染的细胞株又连续培养传代，细胞生长状态良好，说明了重组质粒EGFPleptin可以在异种哺乳动物细胞中稳定表达。

基因的生物学活性单元作为研究生命科学的敏感元件，常常用细胞或分子水平活性测试的方式进行。流体动力学的开发，使得外源基因能够直接在动物体内有效表达[21]。LIU 等[22]利用荧光素酶和β-半乳糖苷酶的cDNA 作为报告基因，证明了通过尾静脉快速注射大量DNA 溶液可以实现高效的基因转移和表达。ARAD 等[22]从小鼠尾静脉注射SV40 载体，可高效传递外源基因到肝脏，导致肝细胞长期有转基因表达。本研究中，将重组质粒EGFP-leptin注射小鼠尾静脉中，在第3天发现，注射组和禁食组小鼠质量下降很快，与正常饲养的对照组小鼠差异显著，与SCHNEIDER[8]的研究结果一致。在正常状况下，机体内脂肪的含量与血液中Leptin 水平维持相对的平衡，当脂肪不断消耗的同时，大量的Leptin 就会释放出来[23]。重组质粒在体内高效表达，小鼠体质量下降的同时，处理组小鼠血清Leptin水平迅速升高，与对照组差异显著，而禁食组虽然小鼠质量也下降很多，但血清Leptin 水平与对照组差异不显著，显然重组质粒的高效表达起了关键作用。

综上，本研究构建的重组质粒EGFP-leptin能够在真核细胞中表达，且表达的融合蛋白具有良好的生物学活性，为进一步研究水牛品质改良或转基因动物的生产奠定基础。