重金属胁迫下植物DNA 甲基化的研究进展

郭天骄，安鹏虎，魏壮状，贾国涛，许肖博，韦 刚，黄五星

（1. 河南农业大学烟草学院，河南郑州 450002；2. 河南中烟工业有限责任公司，河南郑州 450016；3. 江苏中烟工业有限责任公司，江苏南京 210019）

工业快速发展过程中废水、废气和废渣排放导致土壤和水体重金属污染已成为当今最严重的环境问题之一。植物存在于重金属污染的环境中，不能像动物一样主动趋避，但随着时间的推移，植物逐渐进化出在不良环境中的自我保护机制[1]。近年来，研究人员发现了表观遗传修饰在植物抵御重金属胁迫中的重要作用[2]。表观遗传学（Epigenetics）是指在不改变DNA 序列的情况下发生的所有可遗传的基因表达修饰，在维持细胞对基因表达状态的记忆中起重要作用[3]。表观遗传主要包括染色体构型重组、组蛋白修饰（PTM）、DNA 甲基化（DNA methylation）、非编码RNA介导的调控等，其中，DNA甲基化的研究最为深入[4]。

DNA 甲基化具有位点特异性，常见的是在第5个碳原子上发生胞嘧啶甲基化[5]。胚胎发育过程中DNA 甲基化调控转录活性在基因组稳定性（转座子沉默）和基因组印记等关键生物学现象中起重要作用[6]。前人研究表明，DNA 甲基化可以快速修饰植物DNA，减轻植物在恶劣环境中的生存压力，这在植物对重金属胁迫的响应中广泛存在[7]。DNA 甲基化的可逆性能避免过度的基因重组和种群多样性，其可遗传性也为抗性植物育种提供了新思路[8]。鉴于此，分别对植物DNA 甲基化机制、不同重金属胁迫对DNA 甲基化的影响、相关的研究技术以及DNA 甲基化的可遗传性等进行综述，以期为基于基因组选育具有更强抗逆性的植物新品种提供参考。

1 植物DNA甲基化机制

DNA 甲基化是表观遗传学中发现最早、研究最多的调控机制之一[9]。研究表明，在植物中具有组织特异性的DNA甲基化模式，可以通过从单个来源组织再生完整植物的复杂过程稳定地无性繁殖传递[10]。DNA 甲基化的主要形式包括C5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤和N7-甲基鸟嘌呤，其中研究最广泛的是C5-甲基胞嘧啶，即胞嘧啶残基第5 位碳原子上的甲基化现象，是胞嘧啶在DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的催化下，接收来自S- 腺苷-L- 甲硫氨酸（S‑adenosyl‑L‑methionine，SAM）的甲基形成C5-甲基胞嘧啶（5mC）的过程[11]。

在哺乳动物中，DNA 甲基化大多只存在于CG序列中，而在高等植物中却通常存在于以下3 个序列中：CG、CHG 和CHH（H 为A、T 或C）；其是真核细胞基因组重要修饰方式之一，且在不同植物中观察到的甲基化程度亦不同。拟南芥（Arabidopsis thaliana）中甲基化程度分别为CG 序列占比24%、CHG 序列占比6.7%、CHH 序列占比1.7%[12]；木薯（Manihot esculenta）中分别为CG 序列占比58.7%、CHG 序列占比39.5%、CHH 序列占比3.5%[13]；大豆（Glycine max）中分别为CG 序列占比63%、CHG 序列占比44%、CHH 序列占比5.9%[14]；玉米（Zea mays）中分别为CG 序列占比65%、CHG 序列占比50%、CHH 序列占比5%[15]；水稻（Oryza sativa）中分别为CG 序列占比54.7%、CHG 序列占比37.3%、CHH 序列占比12%[16]。总之，一般情况下DNA 甲基化在CG序列中发生率最高，CHG序列次之，在CHH序列中发生率最低。

植物的DNA 甲基化涉及3 个过程：DNA 甲基化维持、从头DNA 甲基化和DNA 去甲基化。DNA 甲基化由不同的酶催化，包括维持甲基化酶和从头甲基化酶。CG、CHG 2 个序列的位点为对称位点，通过甲基化维持机制完成甲基化，其中，甲基转移酶1（Methyl‑transferase 1，MET1）负责催化CG 序列的甲基化，染色质甲基化酶3（Chromomethylase 3，CMT3）负责催化CHG 序列的甲基化[17]。CHH 为非对称位点，其甲基化靠从头甲基化酶实现，即小干扰RNA（Small interfering RNA，siRNA）引导的结构域重排甲基转移酶[Domain rearranged methylase 1（DRM1）和Domain rearranged methylase 2（DRM2）]驱动[18]。而CHH 甲基化的维持需要依靠植物表观遗传的主要途径之一RdDM 途径和一个转录机制来实现[19]。在拟南芥中，CHG 甲基化的维持最主要受CMT3 的催化，少量由CMT2 催化[20‑21]。DU等[22]的研究发现，玉米中CMT3同源蛋白MET2A可以和H3K9me2结合，阻断CMT3 和H3K9me2 相互作用，会破坏CMT3 与核小体的结合，并导致CMT3 失去活性，使DNA 甲基化水平显著下降（图1）。

图1 DNA甲基化和去甲基化的过程（H=A、T或C）Fig.1 Process of DNA methylation and demethylation（H=A，T or C）

DNA 去甲基化包括在DNA 复制过程中失去DNA甲基化的被动去甲基化，以及由DNA糖基化酶家族催化的主动去甲基化。在DNA复制过程中，核因子NF 黏附在甲基化的DNA 上，使黏附点附近的DNA不能完全甲基化，阻断DNMT的作用，为被动去甲基化[23]。而主动去甲基化则是为了平衡基因组的甲基化水平并维持基因表达，通过DNA糖基化酶家族对C5-甲基胞嘧啶的切除来实现活性DNA的去甲基化，然后通过碱基切除修复途径置换胞嘧啶[24]。

在拟南芥中，有4 种DNA 糖基化酶，包括DME（Demeter）、ROS1（Repressor of silencing）、DML2（Demeter‑like 2）和DML3（Demeter‑like 3）。DME、DML2、DML3 的活性可以确保胚乳中的基因组印迹，并对种子发育至关重要[25]。ROS1的主要功能是将DNA 甲基化限制在其靶区域，以避免DNA 甲基化扩散和邻近基因沉默[26]。

2 重金属胁迫对植物DNA甲基化的影响

土壤中适宜浓度的重金属离子有利于植物的生长发育，但过量则会变成胁迫，对植物产生毒害，从而引起植物对重金属胁迫的DNA 甲基化应答。植物通过基因组DNA 甲基化变化控制其相关抗逆基因的表达，进而适应新环境[27]。

2.1 Cd胁迫对植物DNA甲基化的影响

前人研究发现，我国农田土壤Cd、Hg、As 等重金属含量均高于背景值，其中Cd 的潜在危害程度最高[28]。

FENG 等[29]使用高通量单基因亚硫酸氢盐测序方法，在经过Cd 处理和未经Cd 处理的水稻中检测到基因组中超过2 000 个非冗余的不同甲基化位点。YANG 等[30]应用甲基化敏感性扩增多态性（Methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP）技术对镉胁迫下萝卜基因组DNA 甲基化水平进行分析，发现萝卜基因组DNA 的甲基化比例与Cd 胁迫强度呈正比，在油菜中也发现了同样的现象。FILEK等[31]研究发现，较高浓度（600 μmol/L）的Cd 引起了油菜中大部分基因位点的DNA 去甲基化。张思宇等[32]研究发现，在Cd 胁迫下，黄顶菊基因组DNA 重新甲基化和去甲基化2 种甲基化模式均有发生，且以前者为主，并随着Cd 胁迫浓度的升高，2种甲基化发生概率呈逐渐增加趋势，这与孔雀草[33]中的趋势表现一致。

DNA 甲基化水平的升高与植物生长指标及地上部耐受性指数的表型可塑性呈显著负相关，但在不同的植物中表现出不同的趋势[32]。Cd 胁迫可使三叶草和大麻中的胞嘧啶甲基化水平降低20%～40%，且降低程度与重金属离子的胁迫剂量呈正比[34]。Cd胁迫可以促进油菜中DNA的甲基化，但会导致三叶草和大麻中DNA 甲基化水平降低，这表明在不同的植物物种中可能存在不同的甲基化机制，以抵抗重金属胁迫对植物造成的危害。同时，通过MSAP 技术，发现重金属胁迫前后不同植物的CG 位点甲基化模式相似，这表明由胁迫诱导的甲基化变化并不是随机分布的[34]。

当受到逆境胁迫后，植物体通过甲基化改变的调控机制，将受到的毒害降低、变小，从而有利于植株的生长发育、繁殖。在中华水韭中，丁国华等[35]采用MSAP 技术对Cd 胁迫引起的DNA 甲基化程度进行了研究，发现Cd胁迫下的甲基化总体水平与非胁迫对照组基本一致。

2.2 Cu胁迫对植物DNA甲基化的影响

在拟南芥的相关研究中，通过Murashige and Skoog（M&S）培养试验，发现低浓度Cu 胁迫下的拟南芥幼苗MSAP 变化响应比高浓度Cu 胁迫更敏感，因此，拟南芥可用于Cu污染的早期诊断和生态风险评价[36]。

海州香薷是我国著名的Cu矿区金属型植物，在Cu 胁迫下非抗性种群会快速响应Cu 胁迫使得其甲基化状态产生剧烈变化。何宇宁等[37]研究发现，Cu胁迫下海州香薷不同启动子具有不同的甲基化模式，CG 位点的甲基化并未有明显差异，但发现一些特殊的CHG 和CHH 位点的甲基化对Cu 胁迫产生响应并表现出种群特异性。在拟南芥的甲基化研究中也发现了相似的结果，亚硫酸氢钠甲萘醌（MSB）引起了启动子区域的低甲基化状态并且主要位于CHG 和CHH 位点，CG 位点几乎没有受到影响[38]。说明在部分植物中，CHG、CHH 位点可能比CG位点的甲基化更容易受到逆境胁迫的干扰[39]。

SHI 等[40]研究发现，过量的Cu 会触发2 种不同的方式来影响黑藻DNA 的甲基化修饰。一种是增加与DNA 甲基化有关的蛋白质的表达，另一种是由于产生异常的DNA 结构而产生活性氧（ROS）来阻止DNA 甲基化。CICATELLI等[41]采用MSAP技术研究了Cu 过量及未过量土壤杨树叶片表观基因组的变化，发现种植4 个月后的杨树胞嘧啶甲基化模式无明显变化，对其进行菌根治疗6 个月后，其DNA甲基化水平降低。

2.3 Al胁迫对植物DNA甲基化的影响

地壳中铝主要以氧化铝或难溶硅酸盐等形式存在，对植物无害，但在酸性条件下（pH 值<5），一些固定态铝会被活化为可溶性铝（Al3+），从而对多数植物产生毒害。TASPINAR 等[42]在铝胁迫下进行多态性测定时发现，铝（Al）胁迫改变了玉米中的DNA 甲基化，且与长末端重复反转录转座子的多态性有关，表明Al胁迫下的甲基化变化可能是应激防御机制的一部分。

CHOI等[43]通过亚硫酸亚铁甲基化定位发现，被Al 处理后的野生型烟草叶片中，CG 位点在处理1 h内迅速去甲基化，但启动子的甲基化模式未发生改变，6 h内出现NtGPDL转录本。由于DNA 甲基化与组蛋白修饰有关，编码区的去甲基化可能导致染色质结构的改变，从而促进转录。过量的重金属极易导致ROS的过量产生，推测DNA甲基化模式的变化可能是胁迫引起的氧化损伤所导致，同时认为植物对胁迫环境产生的反应是通过主动改变DNA 甲基化状态来实现的[44]。

叶锦培等[45]研究发现，Al 胁迫下的六堡茶苗叶片的甲基化水平均高于对照，并在200 mg/L 时达到最高，在400 mg/L 时略有下降。这可能是Al胁迫导致了六堡茶体内ROS 浓度升高，使甲基自由基产生速度加快，从而促进了DNA 甲基化的变化速率，进而提高了其变化水平，但过高浓度的Al 抑制DNA甲基转移酶的活性，并且该抑制过程不可逆，因而出现一定程度的下降。

2.4 其他重金属胁迫对植物DNA甲基化的影响

其他重金属如Cr、Zn、Pb等，也会对植物的甲基化水平产生影响。LABRA等[46]利用MSAP和免疫标记技术，发现油菜基因组中的甲基化水平与Cr的胁迫剂量呈正相关。ERTURK 等[47]运用限制性内切酶酶切随机扩增技术对Zn 胁迫下玉米基因组甲基化的变化进行研究，发现Zn 胁迫后玉米叶片中有DNA 甲基化的变化，且随着Zn 浓度的增加，甲基化状态发生变化，表明该性状可遗传给后代。李增强等[48]研究发现，Pb 胁迫显著降低了红麻幼苗根系DNA 甲基化率和全甲基化率，提高了根系半甲基化率。qRT-PCR 分析表明，7 个与抗性密切相关的DNA 甲基化差异基因也存在表达量差异，推测DNA甲基化水平变化在红麻响应Pb 胁迫中发挥重要作用。何玲莉等[49]的研究表明，萝卜肉质根中总甲基化水平随Pb处理浓度上升而提高，且甲基化程度的提高主要是重新甲基化所致。

3 DNA甲基化主要研究技术

下一代测序（Next generation sequencing，NGS）技术是鉴定DNA 水平上发生的表观遗传修饰最有效的方法。NGS 技术就是利用DNA 合成新模板的过程，同时大规模地对DNA 进行高效平行测序，可获得大量测序数据。近年来，NGS 技术已经深入贯穿DNA 甲基化的研究中，全基因组亚硫酸氢盐测序（Whole genome bisulfite sequencing，WGBS）方法包括用亚硫酸氢钠处理DNA，使未修饰的胞嘧啶向尿嘧啶转化，维持5mC 不变，有效地将表观遗传差异转化为序列差异，之后与NGS技术相结合对DNA序列进行直接测序。该方法对DNA 有较高的敏感性，其用于大规模平行测序，仅需少量样本便可在全基因组范围内识别DNA甲基化位点[50]。

简化表观亚硫酸氢盐测序（Reduced representation bisulfite sequencing，RRBS）方法与WGBS相比，虽然测序量有所降低，但主要针对多个样本进行差异分析，选取高密度且具有代表性的基因序列进行测序，可对其DNA 甲基化的状态进行高效、准确对比与分析，但受酶切位点的限制[51]。另外，甲基化DNA 免疫共沉淀测序（Methylated DNA immunoprecipitation sequencing，MeDIP-Seq）方法和甲基化DNA 富集并结合高通量测序（Methylated DNA binding domain sequencing，MBD-Seq）方法，均可高效检测复杂基因组以及全基因组范围内的DNA 甲基化水平，二者的区别在于分别结合了单链DNA和双链DNA上的CpG，前者技术可以发现基因组中高度甲基化的区域，如CpG 岛，但不能进行单个碱基水平的分析，且在面对不同密度的CpG 时需要用不同的软件进行矫正，后者的优势在于可以根据DNA甲基化程度的不同主动将其分离[52‑53]。

但是全基因组分析技术会出现胞嘧啶的不完全转化或5mC 的过度转化，容易产生假阳性或假阴性。因此，将下一代测序与高性能计算方法相结合，推动植物育种和遗传学领域发展。通过构建启动子探针载体来鉴定靶区域，运用软件Promoter Scan、Promoter 2.0 对启动子进行预测[54]。软件预测虽然简单快捷，但启动子容易出现假阳性，因此,配合试验筛选可以对启动子的活性及功能实现更精准的检测。通过对启动子活性的差异对比，可以对启动子的序列结构及其转录起始位点距离进行推断与验证，但因为不能特异分离某一基因的启动子片段而产生应用上的局限。除此之外，还有将亚硫酸氢盐测序和焦磷酸测序相结合的方法，用于确定扩增产物中的特定CpG 位点[55]，基于C 和T 的掺入量，确定C 和T与甲基化各个位点的比例，由此分析DNA 甲基化程度的变化。该技术优点是可通过使用具有单核苷酸多态性的等位基因特异性引物来分析基因组印迹，但缺点是成本稍高，性价比较低。

DNA 甲基化的分析技术还包括对甲基化敏感的单链构象分析（Methylation‑sensitive single‑strand conformation analysis，MS-SSCA）方法[56]。该方法采用单链构象来分析甲基化和未甲基化样品之间的序列差异，实时定量PCR 分析完成后，其高分辨率熔解（High‑resolution melting，HRM）曲线还可用于分析代表DNA 甲基化程度的C、T 含量。缺点在于每次分析的数量较少，只能分析1个或几个扩增子。

甲基化敏感性单核苷酸引物延伸（Methylation‑sensitive single nucleotide primer extension，Ms-SNuPE）是一种适用于快速定量多个CpG 位点甲基化发生率的技术，可用于高通量甲基化分析及快速定量胞嘧啶甲基化[57]。在PCR 扩增目标序列和制备PCR 扩增产物后，可在不超过5 h 内，在多达40 个样品中查询2～4 个CpG 位点。缺点是经重亚硫酸盐转化后，PCR 引物及单碱基延伸引物的设计相对复杂，尤其是面临多个位点同时检测的情况下。

EpiTYPER™检测是一种具有区域特异性的检测方法，可通过对选定区域的高分辨率扫描来检测和定量特定区域中的DNA 甲基化[58]。这种方法利用亚硫酸氢盐转化后的DNA 碱基切割和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对DNA 甲基化进行检测和定量分析，以便对单个CpG 周围的区域进行表观基因组分析，并可用于验证通过全基因组方法检测到的CpG。EpiTYPERTM分析的局限性在于只能检查每个切割片段的平均甲基化数据，当1 个片段包含多个CpG 或具有2 个重叠CpG 时，会使DNA 甲基化程度的检测模糊不清（表1）。

表1 DNA甲基化主要研究技术Tab.1 Main research techniques of DNA methylation

4 DNA甲基化的可遗传性

植物细胞可以感知环境的变化，并且会对逆境胁迫做出反应，这些反应包括诱导表观遗传如DNA甲基化，进而诱发表型变异，且这种变异具有可遗传性[59]。这对于提高植物对逆境胁迫的抗性具有积极作用，并使得DNA 甲基化应用在植物育种上成为可能[60]。

植物响应逆境胁迫发生的DNA 甲基化改变可以在分生组织累积并且通过无性生殖和减数分裂遗传给后代[61]。如受重金属胁迫诱导的水稻CHG位点去甲基化状态可以通过雌配子和雄配子遗传给后代[62]。大部分植物具有的是可以稳定遗传的甲基化等位基因，此类基因在植物中表现出了稳定的可遗传性。如亚麻中经由5-氮杂胞苷诱导的低甲基化可以遗传至少3 代[63]，而水稻中因甲基化变异引起的对枯萎病病原体的抗性至少可以遗传9代[64]。CONG 等[65]采用凝胶印迹技术分析了重金属胁迫下水稻及其连续3代植株叶片组织中代表转座子元件和蛋白质编码基因的DNA 甲基化模式，发现DNA 甲基化对重金属胁迫的响应具有跨代遗传性，且植株后代对相同的胁迫条件会表现出更强的耐受性。高水平的DNA 甲基化被认为能够保护DNA 免受核酸内切酶切割和多拷贝转座的影响，这有利于增强植物对重金属的抗性[66]。

在不同环境中，种子DNA 总甲基化水平和链特异性甲基化程度表现出较大差异。在更严峻的胁迫环境条件下由种子生成的幼苗具有更高的链特异性甲基化程度，并可向后代遗传[67]。在甘蓝不同品系之间的MSAP 研究中，进一步证实了遭受逆境胁迫时诱发的甲基化变异具有可遗传性[68]。但也有人认为，在种子形成及发育的早期或许已发生了相关甲基化变异，这些变异遭受不同环境条件的影响，会继续发生变化或者产生逆转，这也表明DNA甲基化的遗传机制较为复杂[69]。

5 小结与展望

植物中的DNA 甲基化不仅存在于长期的基因组进化过程，也存在于短期的响应环境胁迫过程，是植物适应环境变化的重要机制。DNA 甲基化修饰可以对抗逆基因表达水平进行调节，针对动态环境扩展其遗传多样性，以便在面对胁迫时发挥最大作用。目前，表观遗传学的研究已经从早期的单基因甲基化水平向全基因组甲基化水平拓展，并将基因组学、蛋白质学组学和代谢组学等多种组学结合在一起，以期研究DNA 甲基化对植物抗逆方面的贡献。

表观遗传修饰的研究可以对基因型与环境之间复杂的相互作用进行深入剖析，由外部环境对植物的影响入手，从基因层面稳定并提高经济作物的产量和质量。将DNA 甲基化修饰与组蛋白修饰、染色质重塑等相结合，研究重金属胁迫下DNA 甲基化的形成和维持机制，揭示甲基化在生长发育过程中的动态变化，寻找胁迫条件下存在组织特异性差异的原因，并探寻所需DNA 甲基化形态的稳定措施并将其有效应用于育种中。

DNA 甲基化通常有助于高水平基因表达的实现，如果植物在遭受胁迫压力后无法恢复其甲基化水平，则会出现基因的过表达或自身能量的浪费。研究者认为，在胁迫消除后逆转的甲基化变异可以使植物更合理地利用自身生物能。据此推测，可以在人工施加胁迫的条件下，鉴定植物基因组中产生的甲基化修饰，若与抗逆性相关，则可以采用经典的杂交育种方式来开发新品种[70]。

DNA 甲基化修饰的动态特征要求研究人员明确观察的时间点，因此，要在多个时间点进行观察并设置重复试验，以确定胁迫解除后甲基化的变化是否被逆转。随着生物信息学的发展，分子鉴定应用领域逐渐扩大，其中下一代分子标记技术的开发及应用极大地增强了人类监测、了解和利用生物多样性资源的能力，如DNA 条形码技术等[71]。因此，信息提取内容更多、速度更快、成本更低的分子标记技术已成为生物分类学中的研究热点，下一步应重点关注。