液体活检技术在肿瘤诊断领域的应用

宋桂锋，杨海莹

（河北省张家口市万全区中医院普通内科，河北 张家口 076250）

癌症（cancer）一直是世界人民最关注的健康议题之一，其高发病率和高死亡率使得人们谈癌色变。据最新的全球癌症数据统计显示，人类癌症发病率约为21.4%，死亡率约为17.7%，男性癌症的发病率比女性高出20%，即1/5 的男性和1/6 的女性可能患癌，而1/8 的男性和1/10 的女性将死于癌症[1]。癌症已成为全球疾病死亡的主要原因，而基因突变是导致肿瘤产生和发展的重要因素，几乎所有肿瘤都有DNA 突变，这些突变的存在使得肿瘤细胞不同于正常细胞，因此也成为肿瘤细胞检测和追踪的特异性生物标志物。现阶段研究表明，肿瘤中DNA 突变位点和基因种类繁多，且不同肿瘤具有不同的特异性，这也为肿瘤的精确诊疗提供了可能性[2-4]。如何有效利用这些特异性的生物标志物来进行精确诊疗，这就对精准检测技术提出了更高的要求。

近年来，液体活检技术在肿瘤诊断领域成为研究热点，作为体外检验的一个分支，它可以利用人血液、尿液、淋巴液、唾液、脑脊液、唾液、胸腔积液等多种液体样本进行疾病的分子鉴定与检测。其仅需取少量体液，即可通过DNA 测序等手段获得一张更完备的全身癌症的分子图谱，这对于精准医疗来说是一项突破性的技术。相较于传统的组织活检，液体活检技术具有连续监测、多个肿瘤同时监测、可重复性、非侵入性等优势，有助于指导肿瘤的早期诊断、疾病监测、个性化治疗、精准靶向用药、准确预后、预测复发等[5-7]。研究认为，使用体液中的生物标记物进行肿瘤分析将开始改变癌症的诊断，液体活检成为标准的临床工具将具有相当大的临床意义[8]。体液中含有癌症来源的成分，可作为研究对象，实现肿瘤的分子鉴定。基于此，本文就液体活检技术在肿瘤诊断领域中的研究进展作一综述，进一步阐明并归纳其在肿瘤早期诊断及预后判断中的作用，并对该领域的发展趋势进行展望，以期为相关科学研究和临床诊疗提供思路。

1 液体活检对象

1.1 循环肿瘤细胞 循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）是指从肿瘤原发灶和（或）转移灶脱落，游离在外周血液循环系统中的肿瘤细胞。Récamier于1829 年首次报道了肿瘤细胞从肿瘤组织脱落的这一现象，而后有学者提出这些脱落的肿瘤细胞可以穿过正常组织，进入到循环系统造成早期转移[9]。随着检测技术的不断提升，CTCs 的分离和检测得以实现，并首次经FDA 认证应用于临床诊断[10]。CTCs作为完整的肿瘤细胞，携带了包括基因组和蛋白组等大量信息。对CTCs 分离进行体外培养，可通过显微镜直接观测其形态进而判断肿瘤的恶性表型，亦可构建永久细胞株，进行各种体内外功能实验。通过免疫细胞化学实验、荧光原位杂交、单细胞基因组测序等，可鉴定CTC 表型，检测基因突变位点。分离获得的CTCs 还可用于药物筛选、耐药性筛查、为肿瘤患者的个性化治疗提供依据等。此外，CTCs 的发现和分离进一步加深了人们对肿瘤起源和转移机制的认识，肿瘤干细胞、失巢凋亡抵抗、免疫逃逸等领域也得以更深入的研究[11-14]。

1.2 循环肿瘤DNA 循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是指肿瘤细胞死亡或破裂后释放出来的遗传物质，存在于肿瘤患者的循环系统中。ctDNA的发现得益于循环游离DNA（circulating cell-free DNA，cfDNA）的发现，cfDNA 是指来源于人体正常细胞的核酸物质，游离于人外周循环系统中。ctDNA是cfDNA 的一部分，仅指来源于肿瘤细胞的cfDNA，研究人员发现肿瘤患者循环系统中往往存在较高水平的ctDNA，且越接近肿瘤组织区域的ctDNA表达水平越高，而高水平的ctDNA 常提示患者预后不良，这些现象表明ctDNA 的发现对肿瘤诊疗领域具有极其重大的意义[15]。在肿瘤形成早期，人外周循环系统中便可检测到ctDNA 的存在，而CTCs 尚未开始发生，这也就意味着ctDNA 对于肿瘤的早期检测和防治至关重要。ctDNA 作为生物标志物，能随肿瘤基因组的变化而改变，且具有更高的敏感性，动态变化的时效性，与肿瘤细胞基因组信息的一致性，这些特性使其被认为可能是肿瘤基因组的潜在替代物。因此利用ctDNA 监测肿瘤细胞基因组的实时变化，在肿瘤诊疗中具有极大地潜力。

1.3 细胞外囊泡 细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是指由细胞释放的多种具有膜结构囊泡的统称。根据其直径不同，可分为外泌体（直径30～150 nm）、微粒（直径100～1000 nm）、凋亡小体（直径50～5000 nm）和癌小体（直径为1～10 μm），其中目前研究热点为外泌体。起初，外泌体被归类于“细胞垃圾”（cellular waste），科学家们认为这些囊泡物质并没有特定的作用。直到近年来研究发现，外泌体携带有大量的生物学信息，包含多种基因型（如mRNAs、microRNAs、LncRNAs、circRNAs）和蛋白因子等，这些信息类物质主要来源于母细胞，并可以调节下游细胞的生物学功能，激活特定的信号通路，参与免疫应答，肿瘤演进等[16，17]。随着外泌体分离和纯化技术的提高，外泌体的提取变得越发简便，纯度也有明显的提高，其所含有的大量生物学信息也逐渐被挖掘出来，对很多人类基础疾病和癌症中的重要作用也逐渐显现[18]。但是要将EVs 的相关研究成果应用于临床仍需解决一些技术难题，分离和鉴定EVs 的各个亚群需要更广泛和普适性的技术革新，因此目前EVs 的价值主要还停留于实验室的基础研发阶段。

2 液体活检在肿瘤中应用

随着癌症监测和管理策略的不断发展，对癌症早期诊断、预后治疗和耐药性预测等的相关需求也日益增加。然而，尽管目前现有的分子药物可用于靶向特定的基因组或蛋白组，但肿瘤的异质性仍然是个体基因组分析和诊疗方案中最大的障碍。针对这一现象，以CTCs 和ctDNA 构成的液体活检诊断的核心，为癌症治疗和监管的新途径铺平了道路。液体活检提供了一种无创的样本收集途径，在原发性肿瘤难以活检的情况下，液体活检可以作为有效的替代选择，也可以作为实体肿瘤组织的补充活检，其具有检测疾病分子表征的优势，这对精准医学和以患者为导向的治疗至关重要。

2.1 CTCs 为追溯黑色素瘤的起源，有研究采用从黑色素瘤患者体液中分离活CTCs 的方式进行定量和定性分析，结果发现分离细胞的免疫表型揭示了个体间的异质性与临床结果相吻合[19]。CTCs 可用于判断肿瘤患者预后及复发情况，评估肿瘤动力学，做到有效监测指导临床治疗。有明确的证据表明，CTCs 在早期乳腺癌中具有评估患者预后作用，但在日常实践中仍缺乏临床实用性，其局限性在于研究者需要根据上皮表面标志物的表达来评估CTCs的存在[20]。此外，CTCs 还被用于检测肝细胞癌、结直肠癌、胰腺癌等肿瘤的生物标志物[21-24]。现今，CTCs在对某些晚期癌症的化疗疗效和预后预测中也同样发挥着重要作用。在非小细胞肺癌化疗晚期，CTCs的阳性表达与远处转移及临床分期有关，可作为敏感的化疗疗效监测及考核指标[25]。在乳腺癌中，CTCs 能够较早发现微转移，较好的辅助化疗疗效的评估。在不同分期的结肠癌中，CTCs 的表达与结肠癌的恶性程度存在相关性，临床分期越高，CTCs阳性率越高，患者生存时间越短，其可作为判断患者预后的指标[26]。

2.2 ctDNA 在肿瘤早期诊断中，液体活检可以帮助对患者进行分类，并将筛查方式集中于高风险人群，从而减少副作用。在全身性治疗期间，利用CTCs 和ctDNA 分析其对靶向疗法的反应可能会有效增加临床实践的准确性。此外，ctDNA 和CTCs 中的基因组还可有效的标记相应的耐药性突变基因。McEwen AE 等[27]通过提取中枢神经系统肿瘤患者脑脊液和外周循环血液中的ctDNA 进行研究，结果发现脑脊液中的ctDNA 明显富集，且脑脊液中ctDNA 的突变与颅内过程最相一致。Moon SM 等[28]检测了肺癌患者血液中CTCs 和ctDNA 常规肿瘤标志物的表达情况，以此评估两者对肿瘤监控的敏感性，结果显示，无论肿瘤分期或组织病理学类型如何，CTCs/ctDNA组合的敏感性明显高于单独使用CTC 或ctDNA，这表示联合检测的策略可能在临床上更有用，可以增强肺癌的早期发现和诊断。ctDNA 在胃癌的早期诊断当中也有着非常明显的指向性作用，其对于诊断结果的准确性提升有显著的意义。另有研究指出[29]，在非小细胞肺癌中，ctDNA 在预测耐药方面较临床指标更加超前，是一项灵敏的检测指标。同时，ctDNA 还可用于EGFR 基因突变检测及EGFR 耐药突变监测。总之，ctDNA 的定量检测为临床决策提供了便利和准确性，对肺癌、卵巢癌、食管鳞癌等多种肿瘤具有指导性意义[30-32]。

2.3 EVs 研究指出[33]，外泌体具有无创性肿瘤生物标志物的潜力，特异性检测癌细胞来源的外泌体十分关键。外泌体中含有多种内源性货物，部分内容物相当于其亲代细胞并反映亲代细胞的病理生理状态，可检测出与肿瘤相关的多种生物分子，这使其可能成为肿瘤早期诊断的特异性标志物。有研究发现[34]，胃癌患者外泌体的表达水平高于健康人群，外泌体的浓度有可能会成为胃癌的诊断指标。多项研究证明[35-38]，外泌体中包含的遗传物质：mRNA、microRNA、LncRNA、circRNA 才是肿瘤特异性生物标志物的关键因素。目前EVs 的分离和检测已取得重大进展，但于单个平台上解决EVs 亚群的分离和纯化才有可能促进EVs 技术的临床应用。与此同时，通过对肿瘤EVs 进行广泛分析来获取更多的临床验证，也是EVs 得以量化其临床潜力和在疾病进展中作用的必要条件。EVs 作为庞大生物学信息转运的载体，在前期实验室基础研究中已展现出其在临床肿瘤诊断和治疗中的无限潜能。Melo SA 等[39]指出，胰腺癌患者的血清外泌体中存在过表达的磷脂酰肌醇蛋白聚糖1（glypican 1，GPC1），证明了外泌体蛋白作为胰腺癌早期诊断的可行性。外泌体携带的核酸信息物质在肝细胞癌、前列腺癌、胰腺导管癌、膀胱癌的早期临床诊断中也起着决定性的作用[40-43]。虽然外泌体携带的mRNA 相对较少，但也有报道指出，外周循环血中的程序性死亡受体-配体1（programmedcell death-ligand 1，PD-L1）mRNAs 的表达与黑色素瘤和非小细胞肺癌的抗PD-1 抗体治疗反应密切相关，这使外泌体mRNAs 成为肿瘤免疫治疗的分子标志物，可能用于指导肿瘤化疗合理用药[44]。

3 总结

不同液体活检生物标志物均具有其优点和局限性。由于CTCs 和ctDNA 的检测原理、方法、技术和后续分析均存在较大差异，要解决这些问题，使液体活检更好的应用于临床工作，就必须将生物标志物检测的特异性作为研究重点。其目的并非将一种生物标志物作为液体活检的单一检测对象，而是在于使用多种循环肿瘤标志物的协同作用，组成标志物的特定组合，来揭示癌症的特异性，确定癌症的状态、起源和进展。但由于生物标志物的异质性和变异性，该判断尚无定论。

液体活检最终可替代标准组织活检的程度尚不清楚。对于诊断原发肿瘤或确定难以提取样品的组织中转移灶的分期，液体活检可能可提供可靠的选择。液体活检还可以帮助避免在侵入性组织活检后发生并发症，如出血、感染和疼痛等。多年来，研究人员已经明确液体活检的临床潜力。随着分离检测技术的标准化与新型标记物的发现，液体活检将在肿瘤诊断、治疗和预后评估方面拥有广阔的应用前景。为了将其广泛使用，目前需要进行更多的介入性临床试验，并开发出一种将适合的循环肿瘤标志物与疾病发展和转归组合在一起的算法。未来，相信这些检测技术能真正意义上实现快速、可靠的检测效果，最终解决更多的临床问题。