基质金属蛋白酶9与恶性血液病关系的研究进展

马轶，冀林华，崔森，朱明明，罗伟

(1.青海大学附属医院血液科，西宁 810000； 2.南方医科大学附属花都医院血液科，广州 510800)

恶性血液病又称血液系统恶性肿瘤，肿瘤细胞增殖严重影响着人体骨髓造血功能，大量异常的原始细胞随着血液循环进入外周血，影响全身多个系统，最终导致患者死亡。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-9在实体瘤的发生发展过程中发挥重要作用，主要影响实体瘤进展的三个主要过程：血管生成、肿瘤生长、肿瘤转移[1]。MMP-9可预测食管鳞状细胞癌、结直肠癌等患者的不良预后[2]。而对于恶性血液病，MMP-9调节分子功能与作用机制的研究相对较少[3]。MMP-9在恶性血液病的发病过程中起重要作用，其可通过不同机制和作用方式影响恶性血液病的进展。恶性血液病多采用化疗及异基因造血干细胞移植进行治疗，但常规化疗易出现骨髓抑制，增加感染和出血风险，异基因造血干细胞移植适应证较局限，供者配型选择余地小，复发率及排斥率较高。近年来，研究者对MMP-9不同的作用位点进行了相关基础实验，并研制出了相应的靶向药物。现就MMP-9在不同恶性血液病中的发病机制及治疗进展进行综述。

1 MMP-9

1.1MMPs的功能和分类 MMPs是一类依赖锌离子和钙离子的内源性蛋白水解酶，主要由中性粒细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞、血管内皮细胞等细胞分泌[4]，可水解Ⅳ型、Ⅴ型、Ⅺ型胶原以及层粘连蛋白、聚糖核心蛋白等[5]。人体内肿瘤侵袭转移、胚胎发生、缺血缺氧损伤、动脉粥样硬化、炎症反应等过程均与MMPs有关[6-7]。目前MMPs有26种，由于MMPs主要作用底物的差异性，其可划分为5大类：①明胶酶，只包含MMP-2、MMP-9，作用为降解Ⅳ型胶原；②间质胶原酶，包括MMP-1、MMP-8、MMP-13、MMP-18，主要作用是水解Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ型胶原；③间质溶解素，包括MMP-3、MMP-7、MMP-10、MMP-11；④膜型MMPs，包括MMP-14、MMP-15；⑤其他MMPs，包括基质溶解素、金属弹力蛋白酶等[8-9]。

1.2MMP-9的结构 MMP-9是MMPs中分子量最大的酶，又称明胶酶B，由中性粒细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞等分泌，可水解Ⅳ型胶原蛋白，此外还有变性胶原、弹性蛋白、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ和Ⅺ型胶原等。MMP-9在细胞外基质的降解及重塑、血管新生及重构、创面愈合、各种炎症反应、肿瘤生长、浸润和转移等过程中起关键作用。MMP-9基因定位于第20号染色体，由13个外显子和9个内含子组成[10]。MMP-9结构由以下4个主要部分组成：①前肽区，含有一段由半胱氨酸开关序列PRCGXPD组成的自抑制前结构域，此结构域影响锌离子活性位点，阻碍锌离子的活化及抑制催化结构域功能，可使MMP-9失去活性[5]。②催化活性区，首先由一段保守序列HEXXHXXGXXH中的3个组氨酸(His)、谷氨酸(Glu)与锌离子一起构成酶活性中心，然后3个Ⅱ型纤维连接蛋白重复区位于锌离子结合域与活性中心之间，形状类似于口袋，具有疏水性。此种结构使MMP-9具有催化降解细胞外基质Ⅳ型胶原的能力。③血红素样结构区，是位于蛋白C端的血红素样膜锚，血红素样结构区通过抑制MMP-9的自活化而参与MMP-9介导的细胞迁移[11]。④O-糖基化区，此区决定MMP-9的分子大小和空间立体结构，其空间位置在催化活性区和血红素样结构区之间。

2 MMP-9与恶性血液病

造血干细胞的正常生理过程包括造血、增殖、分化和迁移。在骨髓微环境中，MMP-9可从细胞外基质释放，使造血干细胞与细胞外基质细胞相互作用，促进造血干细胞迁移和分化。若MMP-9表达异常升高，基膜的降解促使白血病细胞侵入，并释放MMP-9，造成白血病细胞扩散。此时，造血过程失去控制，则发生异常造血，形成恶性血液病[2]。

2.1急性白血病 1999年,Kuittinen等[12]最早提出急性白血病与MMP-9的联系，研究发现，MMP-9与急性淋巴细胞白血病患者生存率有关，与免疫组织化学法MMP-9阳性表达不增高的病例相比，MMP-9阳性表达增高的病例生存率降低。有研究发现，抑制骨髓微环境中的MMP-9，B细胞性急性淋巴细胞白血病小鼠模型的生存时间显著延长[13]。MMP-9可作为儿童B细胞系急性淋巴细胞白血病的独立预后因素。但有研究报道MMP-9与急性髓系白血病患者的生存率无关，仅与急性髓系白血病的缓解有关[2，14]。

2.2骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome，MDS) MDS患者骨髓及血液中MMP-9的表达水平高于健康人群，抽取MDS患者的骨髓液进行染色体核型分析发现，最常见的为5号染色体长臂缺失，血常规主要表现为大细胞贫血，血小板计数升高或正常，并有进展为急性髓系白血病的风险，此疾病名称可用del(5q)MDS来表示[3]。缺失的5q上有40个蛋白编码基因，其中核糖体蛋白S14基因可导致严重的红系祖细胞生成缺陷。在del(5q)MDS中，转化生长因子-β通路受抑制，MMP-9的表达激活，核糖体蛋白S14基因表达水平显著降低，从而影响红细胞的正常分化，导致红系祖细胞生成缺陷，产生顽固性的大细胞贫血，一般抗贫血治疗无效。有研究通过斑马鱼del(5q)MDS模型证实，MMP-9抑制剂可降低核糖体蛋白缺陷细胞Smad2/3磷酸化，改善红系祖细胞生成缺陷，表明MMP-9抑制剂可作为del(5q)MDS的治疗药物。MMP-9不仅与MDS发病机制有关，也与MDS引起的特异并发症有关[15]。Yamaguchi等[16]研究证实，对于MDS伴无中性粒细胞减少的患者，MMP-9会增加继发性感染机会并延长感染恢复时间，MMP-9升高是MDS严重感染易感性的独立预后因素。

2.3淋巴瘤 淋巴瘤是淋巴细胞增殖分化时发生恶变的病理改变，是一种异质性的恶性血液病[17]，威胁患者的生命健康，抑制淋巴瘤细胞的转移及浸润能力对患者原发病的治疗有重要意义。MMP-9在淋巴瘤转移中同样发挥重要作用，淋巴瘤细胞可迁移到血液或继发生长部位，促进淋巴瘤的扩散及新的病灶形成。张洪叶等[18]采用多株淋巴瘤细胞培养证实了淋巴瘤细胞抑制因子表达上调可使β联蛋白表达下调，MMP-9表达明显下降，从而抑制淋巴瘤细胞生长及穿透基膜及远处转移的能力。

2.3.1慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤(chronic lymphocytic leukemia/small lymphocytic lymphoma，CLL/SLL) CLL/SLL在西方国家发病率较高，也是一种恶性血液病，病理特点是CD5阳性成熟小B淋巴细胞在淋巴结、脾脏、外周血、骨髓过度聚体，首发骨髓为CLL，首发淋巴结为SLL。随着人们生活方式的改变和人口老龄化，我国CLL/SLL的发病率呈递增趋势。MMP-9是一种促血管生成分子，Aguilera-Montilla等[19]证实CLL细胞的条件培养基可增加MMP-9表达，进一步的定量聚合酶链反应及Western blotting结果显示，CLL细胞分泌的MMP-9可促进血管内皮细胞增殖，具体机制为促血管生成基因的表达产物血管内皮生长因子升高，抗血管生成基因的表达产物血小板反应蛋白1和血管生成素2表达下降，当促血管生成基因和抗血管生成基因的变化与微环共同境相互作用时，血管内皮细胞的增殖促进了CLL/SLL的浸润和转移。有研究提示，MMP-9基因沉默可增强MMP-9与CD99之间的联系，导致CD99上调，CD99过表达则可增加细胞迁移。MMP-9与α-4Sp1整合素结合可使β转录因子失活，从而下调CD99 mRNA表达[20]。在淋巴组织中，MMP-9参与的诱导机制较为普遍，CD99与MMP-9的相互作用为CLL的治疗提供了新思路。

2.3.2套细胞淋巴瘤 套细胞淋巴瘤在非霍奇金淋巴瘤中所占比例为3%～10%，属于特殊的小B细胞淋巴瘤，最经典的染色体核型改变为t(11；14)(q13；q32)，两种染色体易位形成一种新的特有基因，此基因编码Cyclin D1蛋白，临床进程具有侵袭性，化疗反应差，传统的“利妥昔单抗联合环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松”方案虽可延长患者总生存期，但无法降低疾病复发率，特定的分子靶向药物显得尤为重要。Yan等[21]用微阵列技术分析发现，在蛋白质-蛋白质相互作用网络中表达水平较高的MMP-9被鉴定为套细胞淋巴瘤的中枢关键基因；在差异表达基因的模块分析中，MMP-9位于重要的基因序列中。因此，MMP-9抑制剂可作为套细胞淋巴瘤的治疗靶点，并设计环肽作为MMP-9的抑制剂，通过分子对接设计证实环肽能与MMP-9的活性位点相互作用，从而阻断MMP-9的活性，降低套细胞淋巴瘤细胞的侵袭性和迁移能力。

2.4多发性骨髓瘤 近年来多发性骨髓瘤发病率呈上升趋势，其病程晚期可出现多浆膜腔积液、低蛋白血症、心功能不全、凝血功能异常从而导致患者死亡，是一种恶性浆细胞病。骨髓微环境包括基质细胞、内皮细胞、免疫细胞和细胞外基质，其与骨髓瘤的发生明显相关，MMP-9通过降解细胞外基质等影响骨髓微环境，促进骨髓瘤细胞生长、浸润及转移，参与多发性骨髓瘤的发病过程[22]。此外，MMP-9水平升高可增加细胞外基质降解，参与多发性骨髓瘤溶骨性骨病的进展，为骨髓瘤细胞生成创造更有利的环境[23]。因此，下调MMP-9表达可抑制骨髓瘤细胞增殖、浸润及减轻溶骨性骨破坏的程度，从而达到临床治疗的目的。徐成波等[24]进行了人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞株实验发现，雷公藤甲素通过抑制含有SET与MYND结构域蛋白3的组蛋白甲基化酶显著下调MMP-9启动子区组蛋白H3K4甲基化水平， MMP-9表达下调导致多发性骨髓瘤细胞株的增殖受抑制，促进了多发性骨髓瘤细胞株凋亡。相应地，雷公藤红素抑制CXC趋化因子配体12/CXC趋化因子受体4轴可降低MMP-9表达，从而抑制骨髓瘤细胞的迁移和侵袭[25]。

2.5骨髓增殖性肿瘤 骨髓增殖性肿瘤的特点是骨髓基质进行性重塑，具体表现为细胞外基质蛋白沉积增加、新生血管形成、纤维组织替代正常组织[7]。

2.5.1慢性髓系白血病 慢性髓系白血病由于第9号染色体q34与第22号染色体q11发生相互易位，从而产生Ph染色体及BCR-ABL融合基因[26-27]。磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)-核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)-MMP-9信号通路与慢性髓系白血病有关[28]，BCR-ABL融合基因具有高度酪氨酸激酶活性，可上调转化生长因子-β1表达，激活PI3K，被激活的PI3K产生第二信使3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇，将Akt引入质膜，Akt随后发生磷酸化，NF-κB抑制性蛋白亚基磷酸化及泛素化后，NF-κB的P65亚基和P50亚基进入细胞核，上调MMP-9基因表达，刺激膜结合细胞因子可溶性kit配体和可溶性细胞间黏附分子1的释放，刺激肿瘤干细胞向外周血的聚集和释放。MMP-9作为快速释放干细胞活性细胞因子可溶性kit配体和可溶性细胞间黏附分子1的决定检查点可引起肿瘤细胞免疫逃逸和动员，造成髓外浸润。慢性髓系白血病特异性BCR-ABL融合基因介导的PI3K-Akt-NF-κB-MMP-9信号通路上调为临床靶向治疗提供了新思路[29]。此外，Corrado等[30]发现慢性髓系白血病细胞的外切体含有的双调节蛋白可激活基质细胞中的表皮生长因子受体信号,促进Snail基因表达，其靶分子MMP-9和白细胞介素-8的表达也相应升高。

2.5.2Ph染色体阴性的骨髓增殖性肿瘤 除慢性髓系白血病外，其他骨髓增殖性肿瘤均无BCR-ABL融合基因及Ph染色体，包括原发性骨髓纤维化、真性红细胞增多症、原发性血小板增多症。这些疾病均可发现Janus激酶2基因突变(原位于JH2第617位的缬氨酸错义编码为苯丙氨酸)、钙网蛋白基因9号外显子突变、新型泛素连接酶基因突变、编码人血小板生成素受体基因10号外显子突变[31]，Janus激酶2基因V617F点突变由于突变率较高，是临床上研究的热点。Janus激酶2基因V617F的突变激活酪氨酸激酶，使Janus激酶-信号转导及转录激活因子信号通路全部激活，其中MMP-9表达升高造成骨髓基质降解，可破坏造血干细胞/造血祖细胞生态位之间的相互黏附，创造一个可将CD34细胞动员到外周血中的蛋白水解微环境，CD34阳性细胞动员后可增强骨髓造血干细胞的增殖分化作用，促进骨髓增殖性肿瘤的发生[32]。芦可替尼为酪氨酸激酶抑制剂，可抑制Janus激酶-信号转导及转录激活因子信号通路活化，阻挡细胞内信号向下一步继续转导，因此下游靶基因与MMP-9启动基因结合受阻，MMP-9表达下降，肿瘤细胞的侵袭及迁移能力下降[33]。

3 MMP-9抑制剂在恶性血液病中的应用

MMP-9抑制剂包括天然抑制剂和人工合成抑制剂，虽然人体可产生MMP-9天然抑制剂，但调节作用较弱，因此有研究人员开发了MMP-9人工合成抑制剂[34]。MMP-9人工合成抑制剂可分为多肽类、非肽类、四环素类衍生物、双膦酸盐四大类，其中双膦酸盐可治疗多发性骨髓瘤引起的溶骨性骨破坏，MMP-9抑制剂是造血过程中的关键调节因子，虽然进行了相应的临床试验，但在恶性血液病中的应用仍面临多种问题[2]。由于MMPs结构的相似性，大多MMPs抑制剂是非选择性的，当抑制MMP-9时也会抑制其他的基质金属蛋白酶，造成临床试验的失败。环肽只作用于MMP-9和MMP-2[1]。MMP-9和MMP-2的S2子位点所含有的氨基酸不同，分别是天冬氨酸和谷氨酸，可以据此设定针对MMP-9的抑制剂。恶性血液病可利用人源化单克隆抗体调控MMP-9的变构位点，许多与B细胞性CLL细胞序列相似的多肽对前体MMP-9也具有较高的选择性[35]。

4 小 结

MMP-9在肿瘤学方面具有降解细胞外基质和基底膜成分，促使肿瘤突破原发部位而发生侵袭和转移的作用[36]。对于恶性血液病，MMP-9可降解由Ⅳ型胶原组成的基膜，因为Ⅳ型胶原为细胞外基质的主要骨架蛋白。MMP-9的表达升高可破坏骨髓微环境，影响骨髓中造血干细胞的黏附过程[37]。MMP-9的异常表达与多种恶性血液病相关，从发病机制到临床前研究，MMP-9作为重要靶点是研究领域的热点，通过MMP-9在不同信号转导途径的作用，可研究出特定分子靶向药物。如在小鼠实验中，通过抑制骨髓微环境中的MMP-9，B细胞性急性淋巴细胞白血病小鼠模型的生存时间显著延长[13]。因此，更多的研究者可针对MMP-9在恶性血液病中的不同作用位点进行更深层次的基础实验及相关的临床试验，为今后恶性血液病的治疗提供新的治疗方式。