蛋白质O-GlcNAc修饰对缺血再灌注损伤保护机制的研究进展

吴科帆，江梦，夏中元

(武汉大学人民医院麻醉科，武汉 430060)

蛋白质作为人类生命物质的基础，需要翻译合成后在内质网和高尔基体上进行翻译后加工才能表达出活性，目前已知的加工类型包括二硫键的形成、化学修饰和剪切等，蛋白质翻译后还会与其他的生物化学官能团结合，使蛋白质产生更多的功能来满足细胞的各项需求。与蛋白质的磷酸化和醋酸化类似，蛋白质的氧连-N-乙酰葡糖胺(O-linked-N-acetylglucosamine，O-GlcNAc)修饰是蛋白质转录和翻译后产生的一种特殊蛋白质修饰方式，也是唯一发生在细胞内的参与细胞信号转导的糖修饰，其对蛋白质的定位、功能、活性都产生了重要影响。自20世纪80年代蛋白质的O-GlcNAc修饰发现以来，质谱技术的发展和生物检测手段的提高使研究人员对蛋白质的O-GlcNAc修饰水平的调控有了新的认识，因此，蛋白质的O-GlcNAc修饰成为一种不容忽视的细胞信号的调节手段。

随着人类对缺血性相关疾病的日益重视，提高缺血再灌注损伤患者的治疗与后期康复水平成为当前临床的重大难题之一，近年来缺血再灌注损伤也成为研究热点。研究表明，重要器官的缺血再灌注损伤与靶器官细胞水平的钙超载、线粒体损伤、全身炎症反应以及氧化应激等因素存在一定的相关性[1]。由于蛋白质O-GlcNAc修饰对细胞内环境的变化非常敏感，在缺血再灌注损伤状态下，细胞内的O-GlcNAc水平在很大程度上出现上调，并激活相应的细胞信号级联通路，因此研究者将蛋白质的O-GlcNAc修饰与缺血再灌注损伤的各种途径联系起来发现，上调的蛋白质O-GlcNAc修饰水平可以参与调控细胞内环境的改变，并对损伤做出反应，从而增强细胞应对缺血再灌注损伤的能力。现就缺血再灌注损伤的发生发展环节中被蛋白质O-GlcNAc修饰的关键蛋白，以及这些关键蛋白的O-GlcNAc修饰水平变化所导致的细胞应激能力变化的主要方式做一介绍，并对蛋白质O-GlcNAc修饰对缺血再灌注损伤保护机制的研究进展予以综述，以期为后期的基础研究和临床治疗提供参考和思路。

1 蛋白质O-GlcNAc修饰简介

细胞中有大约5%的葡萄糖通量进入己糖胺途径(hexosamine biosynthesis pathway，HBP)。HBP分为4个关键步骤，最终将果糖-6磷酸盐转化为尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖(uridine 5′-diphosphate-N-acetylglucosamine，UDP-GlcNAc)，UDP-GlcNAc作为O-GlcNAc的底物生成N-glcnac，在O-GlcNAc转换酶的作用下通过糖苷键连接到丝氨酸或苏氨酸(Ser/Thr)羟基上，进而调节蛋白质的功能。

蛋白质O-GlcNAc修饰是细胞质和细胞核内参与细胞信号调节糖修饰的唯一方式，O-GlcNAc修饰可以改变特定蛋白质在细胞内的位置，使该特定蛋白质转移到其他细胞器产生作用。经O-GlcNAc修饰后的蛋白质也表现出不同的功能，如改变修饰后的蛋白质可与DNA双链特异结合，在转录水平调控细胞的应激状态。O-GlcNAc修饰还可以直接改变蛋白质的活性以及蛋白质的半衰期，影响该蛋白质的作用时间和功能。上述各种改变作为一种广泛动态的蛋白质修饰现象参与细胞应激状态下的各种细胞信号转导，起到十分重要的应激作用[2-4]。

2 O-GlcNAc调控手段

蛋白质的O-GlcNAc修饰通过多种途径参与调控重要器官的缺血再灌注损伤，为了进一步明确糖基化修饰蛋白的种类和对该蛋白质调控的具体手段，需要开展更多关于蛋白质O-GlcNAc修饰途径的相关研究。近年来，越来越多的特异性调控手段被发现，这些调控手段为O-GlcNAc修饰的研究提供了新的思路，并为治疗缺血再灌注损伤的研究提供了新方向。

2.1HBP限速酶 谷氨酰胺果糖-6-磷酸盐中转移酶(glutamine-fructose-6-phosphate aminotransferase，GFAT)是HBP的第一个限速酶，GFAT以两种不同的形式在人体不同的组织和器官中表达并发挥作用，在转录和翻译水平均受到UDP-GlcNAc反馈抑制的调节。GFAT1在胰腺、胎盘、睾丸和骨骼肌中表达；GFAT2在心脏和中枢神经系统中表达。有研究发现，秀丽隐杆线虫中的GFAT1的水平上调，虫体中的蛋白质平衡改善，寿命延长[5]。有研究报道，UDP-GlcNAc对细胞中的GFAT有负反馈调节作用[6]。目前研究常用的GFAT拮抗剂为O-二乙酰-L-血清素(阿泽林)和6-二氮-5-氧化酶，这两种拮抗剂对GFAT的抑制不可逆转，导致细胞分配到HBP途径的葡萄糖减少。

细胞体内其他营养物质(如谷氨酰胺、乙酰CoA和葡萄糖胺)的代谢都可以通过与葡萄糖代谢有关的途径(氨基酸代谢、脂质代谢、葡萄糖氧化等)进入HBP，进而参与UDP-GlcNAc的合成。值得注意的是，由于UDP-GlcNAc的合成需要其他代谢途径的参与，因此O-GlcNAc细胞化也可作为细胞代谢的感应器[7-8]。

2.2O-GlcNAc转移酶(O-linked GlcNAc transferase，OGT)和O-GlcNAc水解酶(O-GlcNAcase，OGA) 在底物UDP-GlcNAc特定的情况下，细胞内蛋白质O-GlcNAc修饰水平受到OGT和OGA的调节。因此，通过激活剂和抑制剂调节OGT或OGA的活动可调节细胞内蛋白质的O-GlcNAc水平。虽然OGT可同时受到磷酸化和糖基化的影响，但迄今为止，尚没有提高OGT活性的具体药理方法。

OGA主要存在于细胞质中，在细胞核和线粒体中亦存在OGA，OGA催化可去除蛋白质的O-GlcNAc修饰。目前已开发的用于O-GlcNAc生物作用研究的OGA抑制剂包括PUGNAc、GlcNAc statin和Thiamet G，均可有效限制OGA的活性。有研究表明，Thiamet G的神经保护作用与微胶质/巨噬细胞极化的变化和核因子κB/p65信号的抑制有关[9]。此外，PUGNAc是OGA的一种强有力的竞争抑制剂，已被广泛用于提高O-GlcNAc水平，重要灌注器官缺血再灌注损伤中葡萄糖胺治疗所提高的细胞蛋白O-GlcNAc修饰水平可以被PUGNAc模仿。然而，PUGNAc不是一种特异性OGA抑制剂(抑制常数KI=0.046 mmol/L)；其还抑制了其他糖苷水解酶，如溶酶体β-六角辛酸酶(KI=0.036 μmmol/L)和β-N-乙酰糖苷酶(KI=6 μmmol/L)。PUGNAc还会导致细胞培养的多种细胞系状态不佳。因此，PUGNAc作为抑制剂的作用并非单一的抑制蛋白质的糖基化修饰，其产生的细胞结局存在差异性，甚至会影响蛋白质O-GlcNAc对细胞的保护作用，降低其潜在的治疗价值。近期研究发现了新的NAG-thiazoline(NAG噻唑啉)衍生物NAG-Bt和NAG-Ae，其OGA的选择性明显高于PUGNAc，这两种OGA抑制剂具有明显的心脏保护作用，如促进心脏功能恢复、减少组织损伤以及降低缺血在再灌注后心律失常的发生率[10]。

2.3内质网应激产物上调HBP通量 缺血再灌注损伤所造成的广泛的细胞应激状态使细胞内质网上的错误折叠和未折叠的蛋白质累积，最终导致内质网应激，内质网应激的3条途径促使细胞对蛋白折叠能力的系统恢复，细胞立即停止翻译并激活基因程序加强蛋白质的折叠和加工，激活内质网相关蛋白降解去除内质网上的错误蛋白。其中，需肌醇酶1途径剪切X盒结合蛋白1信使RNA的编码区，使其发生框移位变，从而表达新的产物——剪切过的X盒结合蛋白1，剪切过的X盒结合蛋白1是一类具有高度活性的转录子，在心肌细胞中激活GFAT1的表达，能够明显上调HBP通量，从而上调UDP-GlcNAc水平，上述途径在缺血再灌注损伤及多种细胞应激条件下均可被激活，使细胞O-GlcNAc修饰水平上调，提高细胞的生存能力。剪切过的X盒结合蛋白1在转录翻译水平将内质网应激与蛋白质O-GlcNAc修饰联系起来，促进细胞的生存[11-12]。

2.4miR-24下调O-GlcNAc水平 近年来，微RNA(microRNA，miRNA)作为天然存在的非编码调节分子逐渐受到关注，20～30个长度的核苷酸的miRNA特异性表达和细胞凋亡与衰老密切相关。通过测定miR-24在心肌缺血再灌注损伤中的潜在靶点，发现了蛋白质的O-GlcNAc连接酶——OGT[13]。在细胞内水平，miR-24与O-GlcNAc连接酶呈负相关，对O-GlcNAc修饰的负性调节的研究显示，通过提高肿瘤细胞中的miR-24水平、降低肿瘤细胞中蛋白质O-GlcNAc水平，可降低肿瘤向周围组织的侵袭能力[14]。

3 O-GlcNAc修饰参与缺血再灌注损伤发生发展过程

3.1O-GlcNAc与钙超载 目前，蛋白质的O-GlcNAc修饰对重要灌注器官的缺血再灌注损伤的保护机制尚不明确。有学者推测，蛋白质的O-GlcNAc修饰水平可能通过调节细胞内Ca2+平衡参与调节心肌缺血再灌注损伤[2]。细胞内Ca2+升高可以激活许多Ca2+调节酶，主要包括蛋白激酶、蛋白磷酸酶、磷脂酶、半胱氨酸蛋白酶钙蛋白和Ca2+/镇痛依赖性蛋白激酶Ⅱ。其中，镇痛依赖性蛋白激酶Ⅱ活性的提高不仅与缺血再灌注损伤后心肌的收缩功能障碍有关，还与细胞凋亡及细胞坏死水平有关。

结构蛋白细胞骨骼蛋白α-fodrin的功能丧失在缺血再灌注中起重要作用。与正常灌注相比，缺血再灌注损伤中α-fodrin的145～150 000裂解片段显著增加。当镇痛依赖性蛋白激酶Ⅱ上调时，α-fodrin的裂解片段减少，缺血再灌注中的心肌细胞功能损伤明显缓解。与上调镇痛依赖性蛋白激酶Ⅱ的结果类似，通过葡萄糖胺或PUGNAc可提高心肌细胞缺血再灌注损伤中的O-GlcNAc水平，也可降低α-fodrin裂解片段的水平，从而减弱再灌注过程中的细胞损伤[15-16]。

同时，葡萄糖胺治疗后引起的UDP-GlcNAc和O-GlcNAc显著增加可以减轻新生儿心肌细胞中血管紧张素Ⅱ诱发的细胞Ca2+过载现象。采用高浓度的细胞外葡萄糖、葡萄糖胺或PUGNAc治疗心肌细胞会导致钙瞬变延迟，而OGT的过度表达会增强这种延迟。因此，在UDP-GlcNAc水平不变的情况下，可使用OGA抑制剂提高O-GlcNAc水平，其与通过葡萄糖胺治疗降低由血管紧张素Ⅱ诱发的Ca2+超载对细胞的影响相似[17]。对使用OGT抑制剂细胞的研究发现，葡萄糖胺导致的O-GlcNAc修饰降低，且由血管紧张素Ⅱ导致的Ca2+增加被抑制[18]。由此可见，O-GlcNAc水平上调参与了心肌细胞Ca2+平衡的调节。

另一方面，心肌肌质网钙离子ATP酶2a(sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase 2a，SERCA2a)是心肌细胞中钙处理的中心，通过内质网膜磷蛋白调节心肌细胞Ser16位点的磷酸化，进而调节SERCA2a的功能，而细胞的O-GlcNAc修饰也参与了Ser残基的修饰，故推测可通过SERC2a的Ser16位点的磷酸化修饰或O-GlcNAc修饰之间的转换影响SERCA2a的功能，通过葡萄糖胺提高O-GlcNAc水平后，内质网膜磷蛋白与SERCA2a的相互作用明显增强[19]，故可将蛋白质磷酸化和蛋白质糖基化修饰联系起来，作为后续蛋白质O-GlcNAc研究的重要关注指标。

3.2O-GlcNAc与线粒体渗透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)形成关系 器官的缺血再灌注损伤导致线粒体的各种功能和结构发生变化，甚至激活线粒体死亡途径。线粒体对细胞的生存至关重要，在ATP产生和细胞死亡的调节中起重要作用。线粒体死亡途径最终会形成跨越外层和内层的线粒体膜、允许低分子量(分子量<1 500)分子进入和退出线粒体基质的一个非特异性mPTP。缺血再灌注损伤产生的钙过载和氧化应激与其他细胞内环境因素的影响共同作用，最终导致内线粒体膜中mPTP的形成。mPTP形成并允许低分子量分子进入线粒体基质，导致渗透压力不平衡、基质膨胀和外线粒体膜破裂，最终导致细胞死亡[20]。

围手术期使用的一些静吸复合麻醉的外源性物质(如肾上腺素、β-阿片激动剂和吸入性挥发性麻醉剂)触发了全身麻醉状态下的预处理，这些外源性物质上调了O-GlcNAc的修饰水平，使术中缺血再灌注损伤所致的梗死面积减小，抑制了mPTP的形成[21]。通过mPTP形成过程可知，mPTP的结构包含脱氧核苷酸转位、环流素D和电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channel，VADC)。相关研究表明，VDAC参与mPTP形成过程的关键步骤是VDAC的O-GlcNAc修饰[22]，经O-GlcNAc修饰后的VDAC不仅在ATP产生及其消耗中起重要作用，还直接参与了mPTP的形成[23]。因此，可以通过上调O-GlcNAc修饰水平提高VDAC的O-GlcNAc修饰水平，从而抑制氧化应激期间mPTP的形成。

适当使用Thiamet G和葡萄糖胺不仅可抑制mPTP开口的形成，还可改善线粒体功能，长期使用Thiamet G和葡萄糖胺可延长细胞线粒体的平均长度，并提高线粒体内复合体Ⅰ和复合体Ⅳ的活性，增强其生物能量。对经Thiamet G和葡萄糖胺处理的线粒体内的RNA进行测序发现，相关基因的表达提高1.5倍，为利用O-GlcNAc治疗代谢疾病提供了新的思路[24]。

3.3O-GlcNAc修饰与活性氧类(reactive oxygen species，ROS)生成 除作为重要信号转导和调节氧化还原的细胞信号外，ROS还参与了心肌细胞的缺血再灌注损伤。由于O-GlcNAc修饰在调节线粒体功能和全身能量代谢方面起基础性作用，通过提高蛋白质O-GlcNAc修饰水平可减少缺氧和氧化应激介导的ROS生成，而使用OGA加剧了缺氧引起的ROS生成[25]。O-GlcNAc修饰通过调节抗氧化酶催化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶的表达或活性来衰减ROS生成，由此可见，O-GlcNAc可作为线粒体的关键调节器[26]。此外，蛋白质的O-GlcNAc修饰调控叉头框蛋白转录因子，对氧化应激反应酶的催化酶的转录进行调控，叉头框蛋白家族亚群叉头框转录因子O1在O-GlcNAc修饰后被激活，进而激活氧化应激反应酶的转录，调节氧化应激相应的下游信号通路及产物，提高细胞氧化应激的耐受性。Thiamet G和葡萄糖胺可影响细胞ROS水平，降低细胞内活性氮、过氧化氢和超氧化物的水平，并通过OGT增强O-GlcNAc修饰或通过OGA减弱O-GlcNAc修饰，以上变化均可显著改变超氧化物歧化酶或谷胱甘肽过氧化物酶的信使RNA水平，表明蛋白质O-GlcNAc修饰水平的升高抑制了ROS的产生[27-28]。

3.4O-GlcNAc修饰与炎症因子 缺血再灌注损伤与炎症密切相关，但炎症细胞和分子的反应方式仍不明确。O-GlcNAc参与了机体免疫的重要过程。特异性敲除去肠上皮细胞中OGT基因表达的小鼠出现肠道炎症，小鼠肠上皮细胞O-GlcNAc修饰水平增加，而化学因素诱发的小鼠结肠炎症降低[29]。此外，O-GlcNAc修饰还参与了调节性T细胞功能的调控，O-GlcNAc修饰水平降低使白细胞介素-2/信号转导及转录激活因子5信号减弱，虽然调节性T细胞的发育正常，但其功能和稳定性下降，导致全身炎症反应的发生[30]。

重要灌注器官的缺血再灌注损伤导致全身炎症因子上调，OGT和OGA抑制剂则明显抑制了缺血再灌注损伤中肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6的表达，同时炎症因子与心肌细胞的结合能力降低。在感染、炎症、创伤、缺血和神经退化时，微胶质细胞与巨噬细胞的激活导致神经元的缺血性死亡，使用Thiamet G后，缺血大脑中的微胶质细胞与巨噬细胞数量减少，且神经细胞中由脂多糖刺激产生的炎症反应受到抑制[31]。上调的O-GlcNAc修饰水平使激活的微胶质和巨噬细胞减少，并可作为缺血再灌注损伤中抑制否定免疫反应损伤的重要保护机制。

4 小 结

蛋白质O-GlcNAc修饰对缺血再灌注损伤保护机制的研究有助于了解重要器官缺血再灌注损伤的分子机制以及阐明细胞O-GlcNAc修饰在缺血再灌注损伤中的作用，为心肌梗死和脑卒中的临床管理提供了新的方向。合理使用OGA和OGT对关键蛋白进行O-GlcNAc靶向修饰，能够起到保护细胞的作用。目前的研究重点为明确O-GlcNAc所修饰蛋白的种类和功能并寻找准确高效调控关键蛋白质O-GlcNAc修饰水平的方式，以增强重要灌注器官缺血再灌注的耐受力。