NADPH氧化酶在心肌纤维化中的作用机制及研究进展

丁雯，李文静，廖海含，张楠，周子颖，牟山琪，唐其柱，夏豪

(武汉大学人民医院心血管内科，武汉 430000)

心肌纤维化是指细胞外基质蛋白在心脏间质的过度沉积，严重的心肌纤维化会影响左心室壁的正常功能，导致心脏收缩或舒张功能障碍。尽管心肌纤维化是心肌肥厚、心力衰竭等多种心脏疾病的共同病理特征，但其具体的病理机制尚未完全明确，目前也未发现能有效改善心肌纤维化的方法。NADPH氧化酶(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase,NOX)广泛表达于心血管系统，且与其他在酶促反应中附带产生活性氧类的酶不同，NOX是专职产生活性氧类的酶。在心肌重构的病理状态下，NOX失调是心脏氧化应激的重要原因之一，而长期的氧化应激状态会导致心肌肥厚、心肌纤维化等一系列心脏病理改变。研究表明，NOX在心肌纤维化的发生发展中发挥着不容忽视的作用[1-2]。因此，明确NOX对心肌纤维化的调节机制有助于更深入地了解心肌纤维化的病理过程。现通过阐述NOX1、NOX2、NOX4和NOX5在心肌纤维化进程中的作用，探讨心肌纤维化的病理机制，以期为心肌纤维化的治疗提供新思路。

1 NOX与心肌纤维化的关系

NOX是一种以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸为电子供体，将氧还原为超氧阴离子和过氧化氢的多亚基跨膜酶。NOX家族由催化亚基(Nox1～5、Duox1、Duox2)、调节亚基(p22phox、p47phox、p67phox、p40phox)以及主要结合配偶体(Rac)组成[3]。NOX的催化亚基由多种不同的基因编码，根据催化亚基的不同，NOX分为不同亚型，心血管系统主要表达的亚型有NOX1、NOX2、NOX4及NOX5，其中NOX1、NOX2、NOX4存在于心肌细胞、心脏成纤维细胞、内皮细胞及血管平滑肌细胞中，而NOX5仅存在于内皮细胞和血管平滑肌细胞中[1]。NOX家族不仅参与内皮细胞迁移、血管生成及炎症反应等多种生理过程，同时也参与心肌肥厚、心肌纤维化等病理过程。病理条件下，NOX产生的活性氧类可增加数倍，进而改变细胞内生物大分子的功能及氧化还原状态[2,4]。

心肌细胞胞外基质生成与降解失衡所致的瘢痕组织生成称为心肌纤维化。在氧化应激状态下，活性氧类参与调节基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)及金属蛋白酶组织抑制物的表达，过氧化物通过促进成纤维细胞向肌成纤维细胞转化而间接促进细胞外基质的合成[5]。因此，NOX失衡导致的氧化还原状态的改变与心肌组织中胶原的沉积密切相关。根据纤维化的起因，心肌纤维化可分为修复性心肌纤维化和反应性心肌纤维化，前者主要是缺血所致的心肌细胞死亡后的修复反应，而后者则是与肥厚型心肌病相关的间质与血管周围的纤维化[6]。不同起因所致的心肌纤维化中，受氧化还原调节的信号通路也不尽相同，各型NOX则通过调节肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、MMP等促纤维化通路参与纤维化进程。

2 NOX各亚型在心肌纤维化进程中的作用机制

2.1NOX1在心肌纤维化中的作用机制 NOX1的主要功能是产生超氧化物，并将其迅速转化为过氧化氢。NOX1可被多种激动剂如促炎因子(肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β)、氧化型低密度脂蛋白等激活。此外，血管活性肽、脂多糖、血流剪切力等可上调血管壁中NOX1的表达[7-11]。NOX1复合体由催化亚基Nox1、调节亚基(p22phox、p47phox、p67phox)及Rac1构成，在外界刺激下，p47phox的丝氨酸残基发生磷酸化，导致构象改变，使调节亚基转位至膜上，从而激活NOX1。生理状态下，低水平的NOX1参与血管生成以及细胞的生长、增殖、迁移、凋亡等多种生理过程[8]。但在炎症等病理因素刺激下，心血管系统中NOX1的表达显著上调，此时远高于生理水平的NOX1产生过量的超氧化物，加剧心血管系统的病理性重构[12]。

在Iwata等[13]的研究中，敲除NOX1基因能够抑制阿霉素诱导的心脏毒性中羟基脯氨酸、纤维粘连蛋白、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)等促纤维化因子的升高，减轻心肌纤维化。心肌细胞以NOX1依赖的旁分泌形式分泌钙结合蛋白S100A1，促进成纤维细胞的增殖与胶原合成[13]。在慢性胰腺炎、肝损伤等其他器官疾病中，NOX1也促进了成纤维细胞的胶原合成[14-16]，在糖尿病肾病中，NOX1表达的抑制减轻了肾脏纤维化[17]。另有文献报道，NOX1参与了自发性高血压中醛固酮介导的血管纤维化[18]。血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)能够激活心肌细胞中的p47phox亚基，以诱导氧化应激[19]，由于调节亚基p47phox的活化能够激活NOX1，故推测NOX1很可能参与了RAAS相关的心肌纤维化。虽然既往研究揭示了NOX1的促纤维化作用，但NOX1在心肌纤维化中的确切作用尚不明确。根据NOX1在其他器官纤维化过程中的作用推测，NOX1对心脏成纤维细胞的作用可能是揭示其在心肌纤维化中确切作用机制的潜在切入点。

2.2NOX2在心肌纤维化中的作用机制 NOX2主要在心肌细胞和内皮细胞表达，生理状态下参与血管张力调节、免疫防御、信号转导等，并可作为氧感受器。NOX2复合体由催化亚基Nox2、调节亚基(p22phox、p47phox、p67phox、p40phox)以及Rac组成，活化的NOX2主要位于细胞膜，以产生超氧阴离子为主，Rac与细胞膜的结合是NOX2激活的关键步骤[20]。病理状态下，上调的NOX2通过产生过量的活性氧类参与病理性信号通路的信号转导，以促进心肌重构。已知的诱导心肌细胞和内皮细胞产生NOX2的主要刺激因素有G蛋白偶联受体激动剂(AngⅡ、内皮素1)、生长因子、细胞因子(肿瘤坏死因子-α)、机械应力、代谢因素(葡萄糖、胰岛素)等[3]。

Wang等[21]发现，与8月龄大鼠相比，30月龄大鼠心脏中的NOX2表达水平显著升高，CTGF转录增加、心肌纤维化面积显著增大、MMP-2与金属蛋白酶组织抑制物的表达失衡，且血管紧张素转换酶、血管紧张素原、血管紧张素1型受体等RAAS组成因子表达增加，同时连续注射AngⅡ28 d的8月龄大鼠的心肌纤维化改变与30月龄衰老大鼠一致。在Johar等[22]的研究中，皮下注射AngⅡ2周后小鼠心脏表现出NOX2活性增加，间质纤维化面积增大，纤维粘连蛋白、前胶原Ⅰ、CTGF、MMP-2等促纤维化因子表达增强；而在NOX2-/-小鼠的心脏中以上表现却被抑制，且螺内酯通过抑制醛固酮受体间接抑制了AngⅡ诱导的心脏NOX2活性的增强以及间质纤维化面积的增加。以上研究提示，RAAS的激活可以上调NOX2的表达，而后者则继续促进促纤维化因子的表达和细胞外基质蛋白合成与降解的失衡，NOX2在RAAS诱导的心肌纤维化中发挥着重要的推动作用。Zhao等[23]在阿霉素诱导的心肌重构中发现，与野生型小鼠相比，NOX2-/-小鼠表现出心肌纤维化区域缩小、促纤维化基因如前胶原Ⅲα、TGF-β、CTGF等表达减少以及MMP-9活性降低。在阿霉素诱导的心脏氧化应激中，Lin等[24]用抗氧化剂黄芪甲苷抑制了心脏中NOX2的表达，心肌纤维化面积也随之减少，推测NOX2在阿霉素诱导的心肌纤维化中发挥促进作用，抗氧化剂对氧化应激的抑制作用可能在一定程度上抑制了NOX2的激活。此外，Yin等[25]还发现，NOX2可通过活性氧类/p38通路介导异丙肾上腺素诱导的心肌纤维化。综上，NOX2促进了AngⅡ、阿霉素及异丙肾上腺素等多种病理刺激下的心肌纤维化。区别于动物心脏纤维化模型中人为干预的单一性，人体心脏疾病中心肌纤维化的发展常受到神经体液等多因素的调控，考虑到NOX2广泛参与了不同刺激诱导的心肌纤维化并且是多种促纤维化通路的共同下游效应物，NOX2有望成为治疗心肌纤维化的重要靶点。

Li等[26]发现，远端非梗死心肌组织中NOX2的激活增加了内质网应激，促进了心肌梗死后左心室的心肌纤维化进程。Looi等[27]发现，在心肌梗死模型中，与野生型小鼠相比，NOX2-/-小鼠心肌收缩功能改善，左心室扩张、心肌细胞肥厚、细胞凋亡、间质纤维化明显减少、MMP-2活性降低。进一步研究表明，心肌细胞特异性过表达NOX2小鼠的CTGF、核因子κB、MMP等促纤维化因子表达增加，间质纤维化明显增加，而内皮细胞特异性过表达NOX2小鼠与野生型小鼠细胞的心肌纤维化水平比较差异无统计学意义[28]。因此，NOX2对纤维化的促进作用有细胞特异性，与内皮细胞的NOX2相比，心肌细胞的NOX2在心肌梗死后心肌纤维化等一系列心室重构过程中发挥着重要的作用。在心肌梗死模型中，内皮细胞特异性过表达NOX2小鼠的心肌纤维化程度与野生型小鼠并无差异；但在AngⅡ诱导的心肌肥厚与纤维化中，内皮细胞特异性过表达NOX2小鼠心脏却表现出内皮-间充质转化增强，而这种内皮-间充质转化增强也促进了心肌纤维化进程，使心脏在保留收缩功能的同时发生了左心室舒张功能障碍[29]。由此可见，NOX2在心肌纤维化中的作用不仅有细胞特异性，还取决于纤维化的起因，具有通路特异性。作为研究较多的NOX家族亚型，NOX2在心肌纤维化中的作用是目前心肌纤维化研究的热点之一，也为心肌纤维化的治疗提供了重要靶点。

2.3NOX4在心肌纤维化中的作用机制 NOX4是心血管系统中表达量最多的NOX家族成员，由催化亚基Nox4与p22phox结合而成，主要定位于内质网膜和线粒体膜上，其产生的活性氧类以过氧化氢为主。与其他NOX亚型不同，NOX4的激活不需要Rac或其他胞质调节亚基的参与，生理状态下NOX4在体内可以持续保持低水平的活性，其产生的低水平的活性氧类还可作为第二信使参与细胞内信号转导，从而促进细胞增殖、迁移、凋亡、自噬等过程。但在心力衰竭、心脏压力超负荷等病理状态下，心肌细胞线粒体中的NOX4上调，活性氧类增加，线粒体蛋白被氧化，线粒体功能障碍导致的电子泄漏又导致了活性氧类的增加[30]，所以作为线粒体氧化应激的重要来源，NOX4是心脏压力超负荷期间氧化应激和心功能障碍的关键介质。

心脏特异性过表达NOX4的转基因小鼠在13～14月龄时表现出左心室功能下降，心脏过氧化物水平升高以及纤维化增加[31]。不同于生理水平NOX4的正常生理功能，高于生理水平的NOX4表现出对衰老心脏纤维化的不利影响。研究表明，多种激动剂(如TGF-β、AngⅡ)和细胞应激状态(如压力负荷、缺氧、心肌缺血)等均可上调NOX4的表达，其中TGF-β可在多种类型的细胞中上调NOX4的表达[30,32]。TGF-β促进成纤维细胞向肌成纤维细胞转化以诱导心肌纤维化，TGF-β基因敲除小鼠表现出明显的抗心肌纤维化和抗心肌肥厚效应[33]。在高血压大鼠的心脏中，TGF-β的抑制伴随NOX表达的下调与胶原蛋白表达的减少[34-35]。Cucoranu等[36]的研究证明，在心脏成纤维细胞中，NOX4产生的活性氧类通过长期促进Smad2/3的磷酸化，上调α-平滑肌肌动蛋白的表达，进而介导TGF-β诱导的心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化。在心脏特异性过表达TGF-β的小鼠中，心室成纤维细胞与心房成纤维细胞中NOX4表达量的差异导致了两者胶原蛋白沉积量的差异[37]。NOX4基因敲除能够消除TGF-β引起的心脏成纤维细胞中α-平滑肌肌动蛋白与胶原蛋白表达的增加[38]。Goh等[39]用线粒体靶向抗氧化剂处理经TGF-β刺激的心脏成纤维细胞后，成纤维细胞的线粒体氧化应激明显改善、NOX4被抑制，同时细胞中TGF-β/Smad通路蛋白显著下调，并伴随CTGF和胶原蛋白的减少。综上，NOX4是TGF-β诱导的心肌纤维化的重要下游效应物，而依赖于NOX的氧化还原信号也可以正反馈的方式调节TGF-β/Smad信号转导通路。虽然这一正反馈调节已在肾小管上皮细胞中得到了证实[40]，但仍需要进一步研究以确认在心肌成纤维细胞中是否也存在同样的正反馈调节。

Zhao等[41]的研究发现，在AngⅡ诱导的心肌重构中，心肌中上调的NOX4通过激活蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/核因子κB信号通路推动心肌纤维化。在酒精性心肌病大鼠中，肾素受体通过激活心脏成纤维细胞中的NOX4增加胶原合成，促进心脏纤维化与心功能恶化[42]。此外，AngⅡ通过激活NOX4依赖的细胞外调节蛋白激酶诱导心脏成纤维细胞迁移[43]。抑制醛固酮降低NOX4的活性，从而减少过氧化氢诱导的心脏成纤维细胞的迁移与增殖[44]。RAAS中的AngⅡ、肾素受体及醛固酮均可通过NOX4促进心肌纤维化。NOX4也是RAAS的下游效应物，并在RAAS诱导的心肌纤维化中扮演重要角色，所以对NOX4的干预极有可能会对心脏纤维化的发展产生较大影响。生理状态下NOX4持续激活，如何将心脏中NOX4的激活控制在既不影响生理功能又不加剧纤维化或许是下一步研究的难点。

2.4NOX5在心肌纤维化中的作用机制 NOX5仅由催化亚基Nox5构成，是一种钙依赖的NOX亚型，主要在血管中表达，分布于内质网等核周细胞器中。NOX5产生的活性氧类为超氧化物与过氧化氢。生理状态下，NOX5可引起的血管收缩[45]，并在多种类型的细胞中调节钙离子内流以及信号转导。NOX5丝氨酸/苏氨酸残基的磷酸化可调控NOX5对钙离子的敏感性，多种蛋白激酶(如蛋白激酶C、胞外信号调节激酶1/2)可影响NOX5的磷酸化，促炎转录因子(如核因子κB、激活蛋白-1)能够上调NOX5的表达[46]。

在动脉粥样硬化、高血压、心肌梗死以及主动脉瘤等疾病中，血管中NOX5的表达增加[46-48]。在人主动脉内皮细胞中过表达NOX5增加了环氧合酶2的表达与前列腺素E2的合成，从而促进炎症反应[49]，心肌细胞特异性表达人源NOX5加重了心脏压力超负荷小鼠的左心室肥厚、间质纤维化和收缩功能障碍[50]。NOX5广泛参与了心血管系统疾病的病理过程，并很可能促进了压力超负荷诱导的心脏病理性重构。此外，NOX5的过表达能够促进人肝星状细胞的增殖与纤维化反应[51]，而内皮细胞或血管平滑肌细胞特异性表达人源NOX5加重了糖尿病小鼠的肾纤维化[52]。由于心肌纤维化是多种心脏疾病的共同表现，再加上NOX5参与了肾脏与肝脏的纤维化，推测NOX5可能参与了心肌纤维化过程。由于NOX5不同于其他NOX亚型的结构以及钙依赖特性，可能在心肌纤维化中发挥与其他NOX亚型不同的作用。但由于啮齿类动物缺乏NOX5的表达，动物实验的缺乏在一定程度上限制了NOX5的基础研究，目前尚不清楚NOX5在心肌纤维化中的确切作用。

3 小 结

作为活性氧类的重要来源，心血管系统中的NOX通过不同的作用机制促进心肌纤维化的进程。但也有研究认为，在应对慢性压力负荷的心脏适应中，心肌细胞中的NOX4能够保留心肌毛细血管的密度，通过增加血管生成起心脏保护作用[53-54]。在心脏的缺血再灌注损伤中，NOX2与NOX4可作为心肌适应缺氧的生理性感受器，产生低水平的活性氧类，并通过调节缺氧诱导因子-1α和过氧化物酶体增殖物激活受体α发挥心肌保护作用[55-56]。所以NOX产生的活性氧类既可以促进心肌纤维化，在心肌重构中表现出不利作用，也可以在心肌的慢性缺氧适应中发挥保护作用，而其是否表现出不利作用取决于活性氧类的基础水平，这可能是临床上单纯使用非特异性抗氧化剂抑制活性氧类治疗心肌纤维化结果不理想的原因之一。作为专职产生活性氧类的酶，NOX调节方式的复杂性为心肌纤维化提供了一种细胞、组织或通路特异性的潜在治疗方式。在未来的研究中，对特定NOX亚型的调控可能是未来心肌纤维化治疗的新方向。