Wnt/β-catenin信号通路在骨肉瘤中的机制研究进展

王安然，张文净，王朝夫

骨肉瘤是一种恶性骨肿瘤，发病人群以儿童及青少年为主，累及长骨干骺端、股骨远端及腔骨近端等[1-2]。目前，骨肉瘤的诊断和临床治疗有了明显的改善，但仍有50%的骨肉瘤患者在确诊时已发生远处转移，外科手术的治愈率不足20%，随着放、化疗治疗方案的不断完善，治疗效果有所提高，但骨肉瘤患者5年生存率仍较低[3]。

Wnt是一种具有生物调节作用的分泌蛋白，已知Wnt与多种肿瘤产生及进展存在相关性，如在乳腺肿瘤、结直肠肿瘤、肝肿瘤及胰腺肿瘤等中均存在Wnt异常表达，Wnt相关转录因子加快整个通路异常活化，导致肿瘤细胞过度增殖。Wnt信号通路主要分为两种形式发挥细胞转导作用，一种是细胞间交流，另一种是自体细胞的交流。Wnt信号通路存在高度保守型，按照信号传递方式分为经典及非经典通路途径，共同发挥生物调节作用[4]。以往文献证实，Wnt信号通路表达上调能够加快肿瘤形成，β-catenin是Wnt发生作用的关键因子，是信号从细胞质转递至细胞核内的关键环节[5]。正常细胞内β-catenin含量较少，主要表达于细胞质，另一部分主要与其他信号通路(如GSK-3p)形成复合体，大部分表达于细胞膜，具有调节细胞间黏附作用。β-catenin能够在Wnt激活时进入细胞核，发挥启动靶基因而增加肿瘤细胞生长及增殖等作用[6]。目前，关于Wnt/β-catenin信号通路与骨肉瘤的产生、治疗的相关文献较少。因此，探讨Wnt/β-catenin在骨肉瘤中的作用对了解疾病发生、发展机制具有重要作用。本文针对Wnt/β-catenin信号通路在骨肉瘤中的机制研究进展作一综述。

1 Wnt信号通路及相关蛋白

Wnt是在乳腺癌小鼠模型中发现的具有细胞生长发育调节作用的蛋白，能够导致果蝇无翅，随着分子生物技术的进步在人类器官中发现了Wnt基因。Wnt能够结合自身细胞膜上的受体发挥生物作用，但是不同Wnt蛋白在不同生理病理中存在特异性[7-8]。Yun等[9]的研究结果证实Wnt蛋白中一个半胱氨酸能够被棕榈酰化，提示Wnt蛋白受脂质化调节。Frizzled1(FZD1)是FZD基因家族，是参与编码Wnt受体蛋白的基因，FZD1为反复7次跨膜蛋白，其是Wnt信号通路的受体蛋白，能够参与Wnt经典及非经典通路途径[10]。蓬乱蛋白(dishevelled, DVL)是Wnt信号调节蛋白，由670个氨基酸残基组成，作为关键的中间信号分子介导不同Wnt信号通路的激活,其包括3个高度保守的结构域DIX、PDZ和DEP，其中DIX结构域介导经典Wnt信号，DEP结构域在非经典Wnt信号通路中起作用，而中间的PDZ结构域在两种通路中均起作用[11]。

2 β-catenin结构及功能

β-catenin是由多肽链组成的位于人体染色体3p21-3p22的蛋白，因位置不同而存在两部分功能：(1)β-catenin能够在细胞膜上与E-cadherin结合后发挥细胞之间连接作用；(2)参与Wnt信号通路，可以作为下游因子在细胞核中激活核转录因子而启动细胞转录作用[12-13]。正常情况下，β-catenin主要集中在细胞膜，少部分与GSK-3β及轴素形成多聚蛋白聚合物，导致β-catenin磷酸化，进一步被泛素蛋白所降解保持低水平状态。但当Wnt活性升高时，FZD1能够连接其他信号蛋白形成复合物，抑制GSK-3β对β-catenin的降解能力，增加细胞质中β-catenin的含量，当β-catenin含量达到一定水平时能够从细胞质中进入细胞核，发挥肿瘤信号传导作用[14]。

3 Wnt/β-catenin信号通路的组成及调节因子

Wnt/β-catenin信号通路传导分别在细胞膜、细胞质及细胞核等完成，Wnt启动依赖于β-catenin进入细胞核而发挥作用。目前，关于Wnt/β-catenin信号通路的研究逐渐深入，其调节因子包含多种。RNF43和ZNRF3均是Wnt/β-catenin信号通路负性调节因子，能够快速识别Wnt受体并能够快速溶解酶破坏而特异性介导FZD受体多泛素化。R-脊椎蛋白1(R-spondin1, Rspo1)是位于人胚胎的脑cDNA的新基因，可在人胚胎及肌肉组织中亦被检测到。Rspo1蛋白可以激活Wnt/β-catenin信号通路[15-16]。

4 Wnt/β-catenin信号通路与骨肉瘤的发生、发展

常用的人骨肉瘤细胞株有SAOS-2、U2OS、143B等，骨肉瘤的发生、发展与多信号通路激活或沉默相关，Wnt/β-catenin信号通路与肿瘤产生具有相关性，Wnt3a和Wnt10b能够增加骨肉瘤实验中小鼠病灶的转移，与激活β-catenin表达相关。相关实验结果证实，Wnt信号能够通过自分泌或旁分泌方式参与骨肉瘤细胞的转移而降低患者的生存率[17-18]。体外实验结果发现[19]，激活Wnt5a、U2OS细胞株后细胞显示出明显的侵袭性，抑制Wnt5a会抑制骨肉瘤的侵袭力。Wnt5b能够联合酪氨酸激酶样孤独受体-2(ROR2)共同促进骨肉瘤细胞的增殖、生长及转移，临床认为可以通过干预该信号通路发挥治疗骨肉瘤的作用。黏结蛋白聚糖2(syndecan-2, SDC2)为抗肿瘤效应的调节剂，在骨肉瘤细胞中Wnt/β-catenin信号通路具有抑制SDC2的表达，反向调节能够利用Wnt信号通路拮抗剂分泌型卷曲相关蛋白1(SFRP1)而增加SDC2的表达，进而改善骨肉瘤疾病的进展[20]。RhoA信号通路是治疗骨肉瘤的靶点指标，抑制RhoA表达能够提高SDC2活性而改善疾病进展，为探索Wnt信号通路在骨肉瘤的发展中提供新的治疗思路。

β-catenin在骨肉瘤组织中的阳性率为70%，与癌旁组织中的表达存在差异。骨肉瘤细胞发生侵袭作用的条件之一为β-catenin，在细胞核内β-catenin含量增加能够促进骨肉瘤细胞上皮-间质转化，增加干细胞形成，上述两种能力均能够增加骨肉瘤细胞的生长及扩散，加快肿瘤细胞的侵袭及迁移[21]。通过调控人骨肉瘤SAOS-2细胞株中PI3K/AKT/GSK-3β信号通路和抑制氧化应激可抑制肿瘤细胞的生长。β-catenin在骨肉瘤的表达与骨肉瘤的发生、发展和转移密切相关，可能在骨肉瘤细胞侵袭、转移的过程中起重要作用，β-catenin可作为骨肉瘤诊断和预测转移的指标。Yang等[22]的实验结果证实，在骨肉瘤细胞中Wnt/β-catenin信号通路中的抑制因子-1(WIF-1)的表达水平显著降低。WIF-1表达降低与Wnt/β-catenin信号通路激活相关，上述结论在众多肿瘤细胞中得以证实，如WIF-1基因在甲状腺乳头状癌中表达下调，促进了β-catenin蛋白在细胞质中的累积，导致靶基因Cyclin D1过度激活。WIF-1能够通过抑制β-catenin表达上调Cyclin D1表达而加快甲状腺乳头状癌细胞增殖及转移。在胆管癌中，WIF-1启动子的甲基化导致其在胆管癌细胞中表达下降，进而不能抑制Wnt/β-catenin信号通路而发挥抑癌作用。WIF-1在胆管癌发生、发展及转移过程中起极其重要的作用。在骨肉瘤细胞体外研究中，WIF-1表达降低，能够导致β-catenin蛋白在细胞质中异常积聚，从而使经典Wnt信号通路过度激活，参与细胞的生长、增殖，促进疾病的发展。Wnt/β-catenin信号通路中存在多种致癌因子，研究发现骨形态发生蛋白9(BMP9)过表达对人骨肉瘤MG63细胞有正性调节作用，该调控作用可能与Wnt/β-catenin信号通路表达激活相关[23]。TIKI2基因在骨肉瘤组织中表达降低，过表达能够减少骨肉瘤细胞的生长和侵袭，这与TIKI2能够抑制Wnt/β-catenin信号通路激活相关。在骨肉瘤中，FHL2作为一种致癌因子，沉默FHL2表达可明显抑制骨肉瘤U2OS细胞增殖并促进细胞凋亡，使细胞阻滞于G0/G1期，FHL2介导了p53对Bax启动子的转录调节作用。相反，FHL2表达升高时能够促进Wnt/β-catenin信号通路激活导致肿瘤形成。

国内最新研究证实，Wnt/β-catenin通路也参与了骨肉瘤的发生、发展，促进细胞外基质的调节，使肿瘤细胞具有侵袭性，诱导肿瘤细胞的免疫耐受和血管生成，最终导致转移扩散的增加[24]。另外，骨肉瘤细胞中典型Wnt信号通路的异常激活似乎与细胞增殖、上皮-间质转化过程的诱导、骨肉瘤促肿瘤细胞干细胞特性的获得以及转移扩散密切相关[25]。在前列腺癌骨转移PC-3细胞中Wnt/β-catenin信号表达活跃，是Wnt配体(Wnt2和Wnt8b)过度活化增加肿瘤细胞生物活性作用，在抑制Wnt2和Wnt8b表达后能够抑制肿瘤细胞增殖及降低骨损伤，基于以上背景，通过给予白鲜碱干预后，β-catenin的核异位增加以及促进β-catenin抑癌作用的靶基因表达增加，癌细胞活性降低。但是部分研究者认为Wnt通路在骨肉瘤中失活，晚期Wnt通路活化促进肿瘤干细胞参与耐药或转移[18]。

最新国际研究[26]，骨肉瘤细胞中Wnt/β-catenin存在异常激活，在原发性或继发性骨肿瘤中能够发挥加快骨肉瘤细胞转移等作用。Wnt/β-catenin信号通路能够通过增加降低骨肉瘤细胞自噬而加快疾病发展。骨肉瘤细胞转移过程中相关信号生物学的改善与肿瘤化疗抵抗性相关，因此针对性改变相关信号通路分子生物学能够显著升高患者的临床疗效。余湘等[27]的实验结果证实，Wnt/β-catenin信号通路能够沉默Beclin1基因而减少MG63骨肉瘤细胞的凋亡，提示Wnt信号与骨肉瘤细胞化疗药物耐药性存在相关性。

5 Wnt/β-catenin信号通路在骨肉瘤防治中的研究

Wnt/β-catenin信号异常活化参与骨肉瘤的生物学行为，侵袭及迁移是骨肉瘤细胞最基本的特征，Wnt/β-catenin信号通路能够通过增加骨肉瘤细胞的侵袭及迁移加快疾病的肺转移，恶化病情。目前，临床关于抑制Wnt/β-catenin信号通路阻碍下游信号通过的研发主要由药物以及酶类抑制剂组成。

5.1 GSK-3β抑制药物近些年，关于针对GSK-3β信号通路的抑制因子及药物逐渐被发现，并已经应用于体外实验研究中。青蒿素存在抗骨肉瘤的作用，双氢青蒿素抑制人骨肉瘤细胞143B增殖及侵袭作用显著，这与能够减少肿瘤血管生成及抑制MMP-9的活性相关，但是青蒿素对骨肉瘤的抑制作用还能够通过抑制其他因子而发挥作用，青蒿素能够降低骨肉瘤细胞中GSK-3β的表达而抑制β-catenin水平，研究机制在于青蒿素能够抑制GSK-3β下游因子Dvl蛋白，发挥Dvl蛋白对GSK-3β及复合物的降解作用而使其活性抑制，从而降低了Wnt/β-catenin信号通路传导作用，能够改善骨肉瘤。向雨晨等[28]的研究结果证实，重楼皂苷(PPI)能够降低骨肉瘤活性的可能机制在于抑制Wnt/β-catenin活性，PPI主要是能够靶向抑制GSK-3β活性，进一步下调β-catenin表达改善病情。

5.2 β-catenin抑制药物夹竹桃苷能够发挥抗骨肉瘤细胞活性作用，研究机制与夹竹桃苷能够抑制β-catenin从细胞质进入到细胞核，降低了Wnt/β-catenin合成及信号传导作用而改善病情。Lee等[29]的荧光素酶报告显示，抑制GSK-3β因子转录能够下调Wnt/β-catenin信号通路中的MMP-2和MMP-9，进而减少骨肉瘤细胞的侵袭及迁移。过表达β-catenin能够增加骨肉瘤细胞系MG-63的体外增长，但是特异性抑制β-catenin基因后能够抑制细胞侵袭及转移，而淫羊藿苷与特异性抑制β-catenin基因作用相似，亦能够降低细胞的生物活性，机制是能够下调GSK-3β表达而间接抑制Wnt/β-catenin信号通路活性相关。

5.3 酶类抑制剂研究证实，酶类物质环氧化酶COX2塞莱希布能够通过激活GSK-3β信号通路减少β-catenin信号异常激活而降低细胞核中转入，增加Wnt/β-catenin信号通路降解而减少骨肉瘤细胞的生长、侵袭及迁移等。TIKI2是抑制Wnt/β-catenin信号通路蛋白酶，在骨肉瘤细胞中表达降低，能够通过抑制下游GSK-3β信号通路的活性，去除N-末端氨基酸而Wnt/β-catenin被寡聚化而失活。通过腺病毒转染TIKI2恢复其表达后促进β-catenin的磷酸化GSK-3β表达，减少细胞核β-catenin水平，抑制了骨肉瘤细胞增殖[30]。

6 小结

Wnt/β-catenin属于经典信号通路，能够调节骨肉瘤细胞的分化、增殖及凋亡。目前，靶向调控Wnt/β-catenin信号通路活性已为临床干预骨肉瘤提供新思路。但是，现阶段还处于研究及探索阶段，临床研究较少。关于此类的研究主要集中在细胞实验及动物实验，能够证实干预Wnt/β-catenin信号通路对骨肉瘤细胞增殖有抑制作用。但是部分学者提出抑制Wnt/β-catenin信号通路对骨肉瘤疾病有改善作用的同时是否能够导致其他不良反应的发生。因此，在后续的研究中应加深对骨肉瘤研究机制的探讨，观察导致Wnt/β-catenin信号通路激活的相关特异性标记因子，开发靶向抑制药物，为临床应用提供强有力的实验证据。