加热灭活对病毒核酸检测的影响与应对措施的研究进展

马碧云综述，杨传坤，陈克平审校

0 引 言

病毒是最小、最简单的无细胞结构微生物。病毒由核心和衣壳组成，两者形成核衣壳。核心由核酸组成，为病毒的复制、遗传和变异提供遗传信息。衣壳是包围在核酸外面的蛋白质外壳。与细菌等其他微生物感染性疾病相比，病毒性疾病传染性强，传播迅速，流行广，特效药物少，更加容易致病。最近蔓延全球的2019新型冠状病毒 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)是人类分离的第七类冠状病毒，是一种RNA病毒[1]。大部分RNA病毒传染性较强，甚至导致重症或死亡，因此在采样和检测过程中要注意生物安全防护。

目前主要利用实时荧光RT-PCR技术对SARS-CoV-2进行核酸检测，此技术快速简便、成本较低，可在早期或潜伏期内识别微量的病毒颗粒[1]。国家卫生健康委员会发布的各版《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》，均明确将核酸检测阳性作为新型冠状病毒感染确诊标准；将连续两次痰、鼻咽拭子等呼吸道标本核酸检测阴性列为出院标准[2]。因此核酸检测在新型冠状病毒肺炎的确诊和预后监测中发挥重要作用。国家药监局已经批准了近20种荧光RT-PCR技术用于SARS-CoV-2检测。然而有研究表明，仅有50%临床确诊病例核酸检测为阳性[3]。核酸检测低阳性率可能与样本采集时机、采集部位，样本运输保存条件，以及试剂质量和操作者水平等因素相关。同时，为保护实验室与操作者，常采用加热方式灭活病毒。然而有研究指出，加热灭活使SARS-CoV-2核酸降解，甚至造成假阴性结果[4-5]。本文主要就加热灭活处理方式及其对病毒RNA检测的影响，尤其对SARS-CoV-2核酸检测的影响，并提出了一些可供参考的解决方法以降低核酸检测假阴性率。

1 加热灭活病毒机制

对疑似新型冠状病毒肺炎患者的标本进行运输、RNA抽提、扩增等均为高风险操作，操作者面临“职业暴露”的风险，必须佩戴三级生物安全个人防护[6]。而加热处理可灭活病毒，可有效保障实验室与操作者的生物安全。加热灭活病毒首先会使病毒的结构蛋白变性，从而改变宿主细胞内参与附着和复制的病毒蛋白构象，致使病毒丧失与细胞受体的结合能力，以终止病毒感染[7]。冠状病毒膜蛋白的热聚集也可能是病毒失活的原因[8]。也有研究发现，加热处理仅裂解病毒衣壳并改变蛋白构象，但不破坏病毒基因组[9]。

2 加热处理可有效降低病毒传染性

病毒灭活方式主要是75%乙醇处理灭活和加热灭活。加热灭活在不同的研究中采用的方案不同。1型脊髓灰质炎病毒经75 ℃加热处理1 h后可失活，柯萨奇病毒B3经55 ℃加热处理15 min后，病毒颗粒被破坏，失去传染性[9]。Kariwa等[10]也发现将SARS病毒在56 ℃加热5 min后，可将病毒感染性从2.6107减少至40TCID50/mL，在56 ℃加热处理60 min或更长时间可完全消除病毒的感染性。诺如病毒经80 ℃加热处理5 min后，17株菌中有16株病毒(94%)的滴度显著降低，平均下降1.1至3.9 log10[11]。关于SARS-CoV和MERS-CoV的研究也证实，加热处理可使冠状病毒失活[12]。

华中科技大学同济医学院附属医院推荐将SARS-CoV-2标本在56 ℃条件下干浴30 min，静置10 min，使气溶胶沉降后再进行核酸检测，可有效灭活此病毒并降低传染性[13]。新型冠状病毒肺炎核酸检测专家共识则推荐56 ℃加热30 min，或60～65 ℃加热20 min，加热过程中每隔10 min轻柔摇匀标本1次，可降低SARS-CoV-2的传染性[14]。发表在bioRxiv上的研究认为，92 ℃加热15 min的方案比56 ℃加热30 min或60 ℃加热60 min的方案更有效；56 ℃加热处理30 min 或60 ℃加热处理60 min的灭活方案，虽可降低病毒载量，但仍有不高于10 TCID50/mL的病毒感染性，而92 ℃加热15 min方案可彻底灭活SARS-CoV-2[15]。

3 加热处理易导致核酸检测假阴性结果

RNA病毒所含遗传物质RNA稳定性差，易被来自于实验环境、试剂、耗材等外源或细胞破坏后所释放的内源RNA酶降解。尤其加热处理后，病毒颗粒的核酸核糖酶被充分激活，导致病毒RNA降解很快。张沁欣等[16]提取斑马鱼胚胎细胞RNA进行实验，证实在无核糖核酸酶抑制剂的保护下，56℃灭活处理将导致RNA的明显降解。因此加热处理可破坏病毒RNA基因组的完整性，同时可减少可用于检测的核酸数量。

在新型冠状病毒感染爆发初期，有研究表明加热灭活不会造成SARS-CoV-2检出率下降[17]。如魏喜生等报道56 ℃水浴处理30 min不会对SARS-CoV-2核酸检测产生影响：将加热灭活标本和未灭活标本比较，对咽拭子或痰液标本均无明显影响，Ct值差异无统计学意义[18]。同时，陈培松等研究报道56℃加热处理30 min或75%乙醇处理咽拭子标本，对SARS-CoV-2核酸检测均无明显影响[17]。但此两篇报道所用样本例数偏少，研究结论需进一步验证。近期越来越多的研究表明，加热灭活过程对于SARS-CoV-2病毒含量较高的样本检测结果无明显影响，但可能会导致病毒含量较低样本的病毒检出率下降，从而产生假阴性结果[4-5，19]，并且加热温度越高对RNA完整性破坏性越强，假阴性率越高[15]。有文献研究发现，将弱阳性标本经加热处理后，近一半的样本呈现假阴性结果，说明加热灭活会降低SARS-CoV-2的RNA载量，检测Ct值变大[4]。刘洁等[20]加热处理咽拭子样本，发现核酸检测Ct 值变大，或 PCR扩增曲线不明显。本科室利用国家卫健委临床检验中心自研的噬菌体病毒样颗粒样本用于SARS-CoV-2核酸检测室内质控， 56 ℃加热处理质控品30 min后，核酸检测Ct值增大，并且加热处理时间越长，Ct值增大越明显。当然，病毒加热灭活处理对RNA检测的影响程度与样本的采集质量、病毒浓度、保存液、试剂盒质量等均有较大关系，有文献发现不同的加热装置和不同的样本量也会影响核酸的提取和扩增效率[20]。

4 降低加热对RNA检测影响可采取的应对措施

SARS-CoV-2诊疗方案与核酸检测专家共识均建议在检测前加热处理样本灭活SARS-CoV-2，防止生物安全隐患发生。加热带来的假阴性问题也值得关注。为了降低检测的假阴性率，以下对策可供参考。

4.1选择合适的样本保存液新型样本保存液可提高加热处理后样品中的病毒核酸可检出量。张沁欣等[16]将293T细胞系保存在三种不同成分的保存液中，经过高温处理后提取样本中的RNA。结果显示，含SDS成分的保存液保存的RNA质量较好，含SDS与蛋白酶K双组分的保存液保存的RNA质量最好，28S和18S条带均明显可见且无拖尾现象。这些结果提示SDS可能具有保护RNA免受RNAase降解的作用。

4.2选择灭活型病毒保存液病毒保存液如含有高浓度胍盐，胍盐具有强烈的蛋白变性作用，可在短时间内迅速破坏病毒的蛋白外壳，同时抑制核糖核酸酶。所以含胍盐的病毒保存液既能有效灭活病毒，又能保护RNA不被降解[3]。研究发现，保存在病毒保存液AVL中的病毒RNA可在32 ℃稳定48 h，在4 ℃或-20 ℃环境下至少可保存35 d[21]。这种灭活型病毒保存液具有较高的生物安全性，无需后续加热灭活处理。因此，使用含胍盐的保存液采集样本，在灭活病毒的同时可稳定病毒RNA，而不影响后续的SARS-CoV-2检测[3]。

4.3同时检测多类型样本呼吸道病毒感染患者可检测标本类型多样，在SARS-CoV, MERS-CoV等病毒感染者的上下呼吸道、粪便、血液和尿液中均可检测到病毒RNA。下呼吸道SARS-CoV-2含量明显高于上呼吸道；肺泡灌洗液中最容易检测出病毒核酸，其次是深痰液，再是鼻咽部，再次是口咽部[22]。目前在加热灭活导致假阴性产生的研究中，所选标本类型中90%为咽拭子，即上呼吸道标本。但也有相关研究证实，加热灭活对不同的标本的影响程度不一致；粪便标本的影响最大，而对痰标本无明显影响[23]。因此在检测多种标本时，需结合实际情况判断。

4.4提高样本采集质量制定样本采集标准操作程序，加强对样本采集人员的培训与考核。采集过程中应控制好采样的距离、力度和时间，尽量避免触碰腺体。要避免样本长时间暴露在外界环境中，因为外界广泛存在的RNA酶易导致核酸降解[24]。使用重组质粒、假病毒颗粒、RNAase P基因以及呼吸道上皮细胞的管家基因等作为内标可以有效监控SARS-CoV-2核酸检测的扩增步骤，而RNAase P基因存在各种类型的SARS-CoV-2样本中，可作为内源性内标可监控从样本采集至扩增的SARS-CoV-2核酸检测全过程[3]。

4.5抗体检测作为补充SARS-CoV-2的核酸检测为阴性时，可采用其他检测方法作为补充。薛雄燕等[25]研究发现56 ℃加热30 min处理SARS-CoV-2血液样本，对采用免疫层析法及化学发光免疫分析法检测SARS-CoV-2抗体无影响。但有研究显示56 ℃加热30 min处理可大幅降低所有样本SARS-CoV-2的IgM滴度，以及64.71%样本的IgG滴度[26]。因此抗体检测仅可作为诊断SARS-CoV-2感染的补充。

4.6可靠的核酸检测试剂与规范的临床实验室目前获批的近20种SARS-CoV-2核酸检测试剂中，检出限从100 copies/mL(华大生物等)至1000 copies/mL(上海伯杰、上海之江等)不等。敏感度低的检测试剂无法检测出由于加热变性导致RNA载量降低的阳性样本，导致假阴性率升高。因此，高敏感性的核酸检测试剂可在一定程度上避免假阴性产生。同时，严格的标准操作程序、完善的质量控制措施可减少实验操作造成的假阴性。

5 结语与展望

选择正确的病毒灭活方式对保障核酸检测的生物安全是非常必要的。加热灭活作为实验室主要灭活方法之一，被广泛应用于各类强传染性病毒，如埃博拉病毒、新型冠状病毒、SARS病毒等。同时我们也应注意到，加热处理可降低病毒RNA载量，温度越高对RNA破坏作用越大，从而导致假阴性结果的出现。在规范实验操作前提下，选择具有RNA保护作用的病毒保存液，或直接使用含胍盐成分的灭活型病毒保存液保存样本，同时检测不同病程采集的多种类型样本以及抗体检测作为补充的处理措施，均可有效降低加热处理导致假阴性带来的临床风险。新型冠状病毒肺炎诊疗方案与核酸检测专家共识均推荐56 ℃加热处理30 min灭活SARS-CoV-2，然而临床实验室采用何种灭活方案需经过实验验证，在灭活病毒前提下选择合适的灭活方案，减少对RNA的破坏作用，最大程度减少假阴性产生。