臭氧处理储粮中真菌毒素及对品质影响的研究进展*

2021-12-03张崇霞朱延光李志民严晓平马一铭

粮油仓储科技通讯 2021年5期

张崇霞朱延光李志民严晓平马一铭陈帅周庆

(1 中储粮成都储藏研究院有限公司 610091) (2 中央储备粮梅河口直属库有限公司 135099)

真菌毒素是真菌的次级代谢产物，在玉米、稻谷、小麦、坚果等农产品中广泛存在，人和动物摄食含毒食品可对健康造成严重威胁。据联合国粮农组织报告，每年全球约有近25%的农作物受到真菌及其代谢毒素的污染，这其中有2%的农作物因为受污染严重而失去营养价值和经济价值，造成的经济损失高达数百亿美元[1]。近年来，受环境和气候条件影响，粮食真菌毒素污染现象有加剧的趋势[2]，已经引起了全社会的广泛关注。

各国对于粮食真菌毒素残留水平均有严格的规定，超出食品安全标准的农产品不能作为食品或食品相关的原料，也不能用作饲料，只有经过去毒处理才能挽回部分应用价值。为此，近年来人们采用物理、化学及生物等多种处理手段开展了农产品真菌毒素消减处理研究，取得了许多突破性的进展，为粮食的数量安全和食(饲)用安全做出了积极的贡献。

各种消减含毒粮食的处理方法中，臭氧处理是近年来人们较为关注的方法之一。臭氧的强氧化性能迅速破坏有机物的双键，同时具有良好的气体渗透性且易自然分解、无毒性残留，在1997年臭氧被美国食品药品监督管理局(FDA)认定为通常是安全的[3]。臭氧降解玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)、呕吐毒素(deoxynivalenol，DON)、黄曲霉毒素B1(Aflatoxin，AFB1)等真菌毒素在国内外也早有报道[4]。本文重点综述了臭氧对粮食中真菌毒素的降解研究，以期为臭氧在真菌毒素降解中的应用提供基础。

1 常见真菌毒素在粮粒上的分布

臭氧较易分解，其对粮粒表面毒素的破坏效果显著高于粮粒内部，因此，研究常见真菌毒素在粮食籽粒上的分布具有重要的意义。研究发现[5-10]真菌毒素在粮食籽粒上分布极不均匀，真菌毒素在粮粒上主要呈现出由外及里的递减趋势，皮层中真菌毒素含量通常高于籽粒内部，不同地区粮食样品中真菌毒素含量在整体上存在较大差异，这是因为真菌毒素的形成除受产毒真菌自身遗传因素的调控外，还受到宿主、环境因素的调控[6]。真菌毒素在粮粒皮层含量较高，主要是因为种皮易于与外部环境中的真菌接触，当条件适宜时，真菌进一步侵染并积累真菌毒素随着真菌不断生长繁殖产毒，菌丝体深入到粮粒内部，则籽粒内部毒素也不断积累。

1.1 玉米赤霉烯酮(ZEN)

职爱民收集[7]全国10个省市82个批次的玉米样品发现，玉米中胚的ZEN含量最多、种皮其次、胚乳最少，霉变程度与毒素含量无明显相关性，不完善粒的筛下物毒素含量明显高于筛上物。胚中ZEN含量最高，因为胚营养丰富、吸湿性强、呼吸旺盛，致使高水分玉米胚部带菌严重。完整玉米在种皮包裹下，可减少或避免霉菌的污染，不完善粒玉米因种皮被破坏，易受镰刀菌感染而产生ZEN毒素。姜淼[8]研究发现，玉米过筛后粉末状物质霉菌毒素含量往往是完整粒的几十倍，过筛去除玉米中的不完善粒及杂质能有效去除部分真菌毒素。

1.2 呕吐毒素(DON)

中储粮成都储藏院[2]利用实验室小麦磨粉机处理呕吐毒素超过国家限量指标的小麦样品，分别收集粗麸、细麸、皮粉和心粉，发现小麦籽粒中DON含量分布呈现由外及里的递减趋势，DON主要分布在籽粒皮层部位，平均质量占比32.45%的外层组织DON总量占比60.82%。职爱民等[9]采集来自全国10个省市的78个批次的玉米,发现DON主要分布在玉米种皮及筛下物中，主要是因为玉米种皮易于与外部环境中的霉菌接触，当条件适宜时，玉米受霉菌进一步侵染并积累真菌毒素。在不同霉变率的玉米中，DON在霉变率高的玉米中含量较高。在含有不完善粒的玉米中，呕吐毒素在其筛下物中含量较高。DON超标玉米经脱皮处理后其呕吐毒素含量很可能达到相关标准限量要求。也有研究发现DON含量高的小麦籽粒干瘪，体积也更小。Chelkowski J等[10]将自然条件下感染DON的小麦过2.5 mm和2.2 mm筛分成四部分，发现籽粒小于2.2 mm的小麦DON含量为15 mg/kg，籽粒在2.2 mm～2.5 mm的小麦，DON含量为14 mg/kg，籽粒大于2.5 mm的小麦，DON含量很低(0～1.0 mg/kg)。

1.3 黄曲霉毒素B1(AFB1)

侯芮[11]研究了自然条件下感染真菌毒素的6个小麦样品，磨粉后收集皮磨粉1B、2B、3B和心磨粉1M、2M、3M、细麸、麸皮共8种组分，研究发现不同AFB1初始浓度的小麦制粉后其面粉或麸皮中AFB1所占的比率也不相同，6个样品中麸皮AFB1的含量是籽粒中含量的1.94～2.69倍；麸皮和细麸(即小麦外皮层)中AFB1占小麦总AFB1比例的48.51%～64.42%。随着小麦中AFB1毒素含量的不断增加，AFB1毒素越来越多的分布在内部的胚乳中。由此可以推断，AFB1由外皮层逐渐进入到籽粒内部，对于污染AFB1毒素程度较轻的小麦，其内部胚乳中AFB1毒素含量不高，制粉后，面粉中毒素含量降低。初始AFB1含量为7.76 μg/kg的小麦，经试验制粉以后，其面粉中AFB1含量降低至5.01 μg/kg，基本符合国家标准规定的安全水平。随着AFB1污染的加剧，小麦中的AFB1逐渐由外层转移到胚乳内部，面粉中毒素含量逐渐增加，去除难度逐渐加大。

2 臭氧对真菌毒素降解效果

臭氧降解真菌毒素的效果主要受臭氧处理浓度、处理时间和真菌毒素存在介质的影响。臭氧对玉米赤霉烯酮、呕吐毒素等真菌毒素溶液降解效果明显，对粮粒上真菌毒素的降解率要低于真菌毒素溶液，这与真菌毒素在粮粒上的分布特点以及粮食水分含量有关。臭氧降解粮粒上的真菌毒素，主要与粮粒表面的真菌毒素反应，同时由于粮食的水分含量普遍较低，使得臭氧在粮粒上的附着和渗透受限，降解真菌毒素效果变差[12-14]。

2.1 玉米赤霉烯酮

齐丽君[4]用5 mg/L的臭氧处理ZEN标准溶液(20 μg/mL)5 s，ZEN的降解率超过90%，当臭氧浓度为10 mg/L和20 mg/L时，ZEN被降低到HPLC检测不到的含量。用40 mg/L～100 mg/L的臭氧处理自然污染ZEN的玉米，当处理时间为180 min时，玉米中的ZEN降解率达到86%，在处理的0～120 min，ZEN下降显著，在120 min～180 min，ZEN下降不明显，主要是由于臭氧容易与玉米表面的ZEN反应，对于内部的真菌毒素臭氧渗透较慢。用100 mg/L的臭氧处理水分14.1%和19.6%的玉米180 min，ZEN降解率为86.0%和90.7%，高水分含量的玉米中真菌毒素的降解效果更好，但这种差距在120 min到180 min逐渐不明显，这可能是因为臭氧与玉米表面的真菌毒素反应，通过玉米气孔进入到玉米内部比较困难。

诸多研究表明水分含量对ZEN降解十分重要，因为水分可以溶解臭氧，增加臭氧气体与真菌毒素的接触。Wang等[14]认为高水分可以提高臭氧的渗透能力和氧化能力，臭氧在水中可以形成氧原子和氢氧根，有利于ZEN的氧化分解，增加水分含量，可以产生更多的自由基，从而对ZEN的降解产生重要影响。

2.2 呕吐毒素

陈帅等[15]研究发现用3 mg/L的臭氧处理浓度为4 mg/L的呕吐毒素标准品水溶液10 min，呕吐毒素100%降解，用相同浓度的臭氧处理不同水分含量的玉米和小麦加标样品4 h和8 h发现，臭氧对绝干玉米和小麦加标样品中的呕吐毒素几乎没有降解作用，随着玉米和小麦水分含量的提高，降解效果有明显提升。水分含量是影响玉米和小麦呕吐毒素降解率的关键因素。实仓验证发现，利用内环流技术维持粮仓内臭氧浓度在3 mg/L～4 mg/L，仓间湿度55%～57%，处理3 d，呕吐毒素降解范围在22.1%～35.1%。玉米脂肪酸值和小麦面筋含量在臭氧处理前后无明显变化，霉菌总数明显降低。

2.3 黄曲霉毒素B1

谢刚[16]用40 ppm～50 ppm的臭氧处理AFB1超标的谷物1 h～2 h，谷物中AFB1的含量显著减少。丁爱凤研究表明[17]，经浓度95 mg/L的臭氧处理25 min，稻谷中AFB1的降解率随着其初始含量的增加，呈现先上升后下降的趋势，可将AFB1初始含量为68.42 μg/kg的稻谷降解到国家限量标准(10 μg/kg)，降解率最高可达88.1%。臭氧对稻谷中AFB1的降解效果受到臭氧浓度、处理时间以及稻谷处理量等因素的影响，在一定范围内，AFB1的降解率与臭氧处理浓度和处理时间成正比。

臭氧的处理浓度、时间和粮食水分含量都会影响到其对真菌毒素的降解效果[18]。用臭氧处理真菌毒素超标的粮食，应用中受臭氧机产量和投资成本影响，臭氧浓度一般能维持在3 mg/L～4 mg/L，由于臭氧主要与粮粒表面的真菌毒素反应，随着处理时间不断延长，在后期真菌毒素降解率很难继续增加。已有的研究证明提高粮食水分含量或通入臭氧的相对湿度，可以提高臭氧对真菌毒素的降解效果[12-14]，因此在实践应用中，可考虑从适当提高粮食水分含量或通入臭氧的相对湿度方面入手，提高臭氧对真菌毒素的降解率。

3 臭氧处理真菌毒素的降解产物

臭氧处理玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、黄曲霉毒素B1后，降解产物复杂，往往含有几种不同的降解产物[3,12,19]，通过液质联用等手段推测降解产物的分子结构和化学式，并且经细胞活性试验、小鼠亚急性毒性动物试验等对降解产物的毒性进行分析，结果表明降解产物的毒性与真菌毒素相比，显著降低[3,12,19]。

3.1 玉米赤霉烯酮

臭氧通过与碳碳双键的亲电反应与有机物反应。ZEN含有一个烯烃双键，使ZEN与臭氧反应更加容易，此外在苯环存在时臭氧易与羟基反应，ZEN的苯环上含有两个羟基。

王轶凡[3]用20 mg/L臭氧处理10 μg/mL的ZEN溶液1 min，产生4种未知的稳定降解产物，臭氧处理5 min后，这4种产物被完全降解而未发现其他新产物。通过超高液相色谱串联四极杆飞行时间质谱分析推测各降解产物的化学式分别为C18H22O6，C18H22O7，C17H20O6，C18H22O8。通过ZEN及其臭氧降解产物的结构对比分析表明：ZEN臭氧降解产物的生成路径主要遵循臭氧与烯烃双键加成的Criegee反应机制和亲电效应，并模拟出4种ZEN臭氧降解产物的生成途径。对降解产物进行体外毒性试验发现，臭氧处理后的ZEN降解产物的毒性显著降低，但仍存在一定细胞毒性，臭氧降解产物完全被臭氧氧化后，其细胞毒性与空白正常组无显著性差异。

3.2 呕吐毒素

呕吐毒素的臭氧降解遵循Criegee机制，即臭氧首先作用于C9-C10上的双键，进行环加成反应，形成不稳定的臭氧化物，随后在臭氧的强氧化作用下生成相关降解产物及过渡态产物[20]。

陈帅等[15]利用高效液相色谱、核磁共振及液质联用等分析手段对臭氧处理呕吐毒素标准品的降解产物进行分离和结构分析，结果表明，主产物为己二酸二甲酯，从其分子结构可以看出，DON分子中的C12、C13环氧结构和C3-OH基团等毒性基团被完全破坏，主产物DMA为一种只含醛酮基团的低毒性化合物。因此，粮食所含的DON进行臭氧处理降解后毒性会显著降低，可显著改善含毒粮食的食品安全性。孙超[19]研究发现，DON被臭氧降解时，高浓度(40 mg/L)情况下DON被快速完全降解，没有新的物质出现，当在低浓度(20 mg/L)条件下降解时，降解速度变慢，检测到两个降解产物，分子式为C15O7H2和C1507H18，降解产物不稳定，属于中间产物，DON完全降解后，对细胞的毒性显著降低。

3.3 黄曲霉毒素B1

臭氧降解AFB1的机理是臭氧通过Criegee机理的亲电攻击，臭氧攻击呋喃环末端的C8-C9双键，最后形成酮、醛、酸和二氧化碳等多种化合物，从而去除黄曲霉毒素的致毒性，因为C8-C9双键是黄曲霉毒素引起细胞突变和致癌性的主要原因[16]。

张芳[1]研究发现，通过HPLC-MS对臭氧降解AFB1的降解产物进行推测，发现臭氧完全降解AFB1最终产生3个氧化产物。Mckenzie等[21]研究发现在臭氧的作用下C=C双键首先发生加成反应，得到分子式为C17H12O9的中间产物，臭氧的进一步作用使得苯环和另一个C=C双键被打破，形成R-COOH(酸类)，R-CHO(醛类)、R-CO-R(醚类)和CO2。通过小鼠毒性试验和Ames致突变试验发现：臭氧处理过的花生粕不再对小鼠造成伤害。臭氧处理过的玉米浆也不再对小鼠健康造成伤害，也不会有致突变的作用。DIAO等[22]研究发现臭氧降解AFB1后检测到10种降解产物，这些产物含量低，且分子量相近，通过对其结构-效应分析可知，AFB1的最终降解产物毒性显著降低。

4 臭氧对粮食品质的影响

用臭氧处理真菌毒素污染的粮食，在降解真菌毒素的同时，臭氧对粮食品质也会产生一定的影响，从已有的研究可以看出，臭氧对小麦、玉米、稻谷等原粮的品质影响较小。

研究发现臭氧降解小麦中DON，小麦粉相比原面粉白度增强，黄度下降。孙超[19]用80 mg/L臭氧水处理小麦10 min，磨粉后小麦粉亮度和白度增加，蛋白含量、淀粉含量和脂肪酸值变化不大。齐丽君[4]用100 mg/L臭氧处理玉米180 min后，玉米粉白度增加、黄度下降。臭氧可以与胡萝卜素、类胡萝卜素的双键反应从而具有漂白作用。玉米含有丰富的胡萝卜素，小麦的主要颜色来自类胡萝卜素，因此臭氧与这些色素的反应可能是导致白度增加、黄度下降的原因。用100 mg/L的臭氧处理玉米样品180 min，随着处理时间延长，玉米脂肪酸值呈上升趋势，但仍在正常范围内。玉米糊化峰值粘度、最低粘度、最终粘度和回生值呈下降趋势。Melte等[4]用同样浓度的臭氧处理被AFB1污染的开心果，开心果的脂肪酸值无显著变化。

Chan等[23]认为，淀粉经过氧化会导致部分糖苷键断裂，淀粉分子量下降，淀粉峰值粘度降低。也有研究表明用臭氧处理蜡质大米淀粉，发现随着处理时间延长，蜡质大米淀粉的峰值年度粘度增加。可能有两个原因：一是臭氧处理后，蜡质大米淀粉中酶的活性降低；二是氧化使淀粉分子发生交联从而使淀粉分子膨胀力增加。淀粉种类不同，处理方式不同也会造成淀粉糊化特性的差异。臭氧处理后玉米中直链淀粉含量呈下降趋势，但变化不显著。臭氧处理会造成高相对分子质量的淀粉聚合物解离，产生低相对分子质量的淀粉聚合物和直链淀粉。臭氧处理时，玉米外壳对其内部的淀粉起到一定保护作用。玉米中氨基酸总量和必需氨基酸含量呈下降趋势，但必需氨基酸与总氨基酸含量的比值无显著变化。庄坤等[17]用臭氧处理糯米，氨基酸总含量减少，这可能是因为这些氨基酸的侧链基团对臭氧比较敏感，容易被氧化。