脂肪干细胞在颅骨缺损修复中的研究进展*

赖文涛，张晓璐，赵志军

(1.内蒙古科技大学包头医学院，内蒙古 包头 014010；2.内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院神经外科；3.内蒙古自治区骨组织再生与损伤修复工程技术中心)

颅骨缺损是创伤、肿瘤、手术等引起的常见临床问题。颅骨缺损导致颅内压变化等临床症状，因此修复颅骨缺损十分必要。目前临床治疗颅骨缺损的主要方法为自体骨、异体骨、钛网等材料修补。如果缺损范围较大，涉及自体骨采集过多，则会导致供体部位功能障碍；异体骨以及钛网等材料存在免疫排斥的风险，目前缺乏一种较好的方法来治疗大面积颅骨缺损。颅骨缺损直径<3 cm可以自愈，不需要进行颅骨修复手术，一般>3 cm的缺损要进行颅骨修复手术。基于干细胞的骨再生和骨组织工程技术是颅骨修复和重建领域的一种尖端技术。脂肪干细胞(Adipose-derived stem cells，Adscs)是一类具有成骨分化潜能的间充质干细胞，具有取材容易、少量组织即可获取大量标本，同时具有体外稳定增殖，适合自体移植等特点，因此在颅骨缺损修复中得到广泛研究[1]。但由于缺少相应的血液系统供应，导致工程骨植入后骨形成不良[2]，这对大面积颅骨缺损的临床重建提出巨大挑战，因此血管生成对组织工程骨的构建具有重要意义。

1 脂肪干细胞的特点及表面标志

1.1脂肪干细胞的特点 2001年Zuk等[3]首次成功分离和培养出Adscs，其特性与骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchyml stem cell，Bmscs)相似。Adscs具有很强的增殖以及多向分化潜能，可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和神经元细胞。Adscs还具有抗缺氧能力强、来源丰富、易于分离、免疫原性低等特点[2]。与骨髓间充质干细胞相比，可以反复获取，并且具有血管分化的潜能[2]。从脂肪组织中获取干细胞的数量至少是同等骨髓中可获取数量的500倍[4]。据报道，Adscs的衰老时间比Bmscs晚，其增殖能力也更强[5]。相比于其他类型的干细胞，Adscs在某些生长因子和免疫调节因子的自分泌中也更为活跃[6]，例如Adscs表达的血管内皮生长因子-D(VEGF-D)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和白细胞介素-8(IL-8)mRNA水平高于其他间充质干细胞群体，包括Bmscs、真皮乳头细胞和真皮鞘细胞。在缺氧条件下，Adscs分泌血管内皮生长因子(VEGF)的数量大约是正常氧条件下的5倍[7]。因此Adscs在缺氧条件下能促进血管内皮细胞生长，减少细胞凋亡。

1.2Adscs的表面标志 Adscs与其他干细胞一样，存在多个表面标志。关于CD34在Adscs中的表达，现有文献存在很大差异，人们普遍认为CD34不存在于细胞表面[8]，然而这一观察主要是基于体外培养的间充质干细胞(MSCs)，而不是组织原有的MSCs。也有研究表明，CD34表达于新分离的Adscs中，并在几次细胞传代后消失[9]。与其他类型的MSCs相似，由于缺乏明确的细胞标记，Adscs仍然难以鉴别。Mizuno等人发现，Adscs相关标记物包括CD13、CD29、CD44、CD63、CD73、CD90、CD166，其在血管基质成分(SVF)细胞中最初表达较低，但会随连续传代的增加而显著增加[10]。因此在考虑通过表面标志物来鉴定Adscs时也需要考虑传代次数等因素。Adscs免疫表型表面标记中阳性表达的因子有CD90、CD44、CD29、CD105、CD13、CD73、CD166、CD10、CD49e和CD59，阴性表达的因子有CD31、CD34、CD45、CD14、CD11b、CD19、CD56和CD146。

2 脂肪组织的提取及分离

2.1脂肪组织的提取方法 脂肪组织主要存在于所有组织和器官的血管周围区域，这些区域的Adscs含量较高，通过微创手术很容易获得，使其成为基于细胞治疗中的合适靶点。通过脂肪抽吸手术获得大量脂肪组织，相比采集骨髓干细胞，其痛苦和创伤相对较小[11]。腹部浅表脂肪组织有较强的多能性和干性特征,标准的整块切除和脂肪抽吸是两种最常见用于获取脂肪组织的手术方法。

2.2脂肪组织的分离 获取脂肪组织是分离Adscs的第一步。第一次分离Adscs是通过适当洗涤，使用1型胶原酶消化，离心分离血管基质成分细胞(Stromal vascular fraction SVF)。SVF被认为是脂肪细胞祖细胞、Adscs以及其他细胞的来源，离心速度会影响细胞产量，1 200 g被认为是最佳离心速度。通过迭代培养，获取贴壁生长的Adscs[12]。目前尚无统一的Adscs培养方法，在开始培养Adscs前，可以洗涤去除血液或其他残留细胞[13]。

3 Adscs成骨分化的影响因素

在某些因素下，Adscs有可能分化为成骨细胞，为在短时间内解决骨相关疾病提供机会[14]。诱导Adscs成骨的因子包括地塞米松、抗坏血酸/抗坏血酸2-磷酸、胆囊钙素和β-甘油磷酸酯，以及转化生长因子-β(TGF-β)、维生素D3和骨形态发生蛋白(BMPs)等[15-16]。也有研究表明一种天然的黄酮类化合物——槲皮素，通过增强Osx、Runx2、BMP-2、Col-1、OPN和OCN等基因的作用，促进小鼠和人Adscs的成骨[17]。Adscs的成骨分化也受转录因子调控，如核心结合因子1α(CBF-1α)、Runt相关转录因子2(Runx2)、Osterix蛋白、同源盒蛋白Hox-B7(HOXB7)、Hoxa2、Hoxa9、核心结合因子β(Cbf-β)、溶血性增强子结合蛋白2β(Pebp2β)、Sox9、TNF-α、FOXC2、PPARγ、YAP、MyoD、BMP9、β-cat GATA4和GATA6[18]。其中转化生长因子β(TGF-β)/骨形态发生蛋白(BMPs)、Notch信号通路、Wnt/β-catenin信号通路和成纤维细胞生长因子(FGF)等被认为是调节Adscs成骨分化潜能的主要信号通路[19]。

3.1地塞米松、β-甘油磷酸酯和血管内皮生长因子A(VEGF-A) 地塞米松通过激活FHL2/β-catenin通路，诱导RunX2和I型胶原α1(COL1A1)的过度表达；β-甘油磷酸酯则提供磷酸盐，增加成骨基因的表达[20]。血管内皮生长因子A(VEGF-A)在骨再生中起着重要作用，因为它同时具有促进人Adscs血管生成和成骨的潜力，Behr等使用VEGF联合Adscs局部治疗小鼠颅骨缺损，相比对照组，使用VEGF处理的Adscs能改善严重颅骨缺损的愈合，并且这种修复伴随着血管的生成而增强[21]。VEGF和BMP-2、4、6、9可通过表达成骨碱性磷酸酶基因促进成骨来进行联合治疗[22]。也有研究表明，缺氧除了促进血管生成外，还被证实可增强成骨潜能。缺氧条件下，IGFBP3的活化会抑制Adscs的成骨潜能，缺氧还会抑制碱性磷酸酶活性、核心结合因子α1(CBFA-1)和骨桥蛋白的表达，导致Adscs成骨潜能的负调控[23]。因此，在缺氧条件下Adscs的成骨分化潜能需要更多研究来证实。

3.2骨形态发生蛋白(BMPs) 骨形态发生蛋白(BMP)是一种细胞因子诱导剂，可用于诱导Adscs的成骨分化。BMP-2和BMP-7的临床意义在澳大利亚、美国和欧洲等地区得到广泛认可。BMP-2、BMP-6和BMP-14被认为是Adscs成骨分化的主要因素，BMP-7则促进软骨形成和成骨[24]。也有人认为，BMP本身不足以指导MSCs分化为成骨谱系，因为它以相同的速度同时触发脂肪生成和成骨。具体来说，BMP信号通路通过配体与异二聚体丝氨酸/苏氨酸激酶BMP受体的结合而激活，从而触发Smad依赖的信号通路(Smad1/5/8)和Smad无关的信号通路(JNK)的激活，最终介导脂肪生成和成骨[25]。Smad4与磷酸化转录因子Smad1、Smad5或Smad8的异二聚体激活Adscs成骨促进基因的表达。

3.3Wnt/β-catenin信号通路 Wnt家族由大量分泌性糖基蛋白组成，其广泛参与胚胎发育、组织诱导分化和体轴分化。大多数Wnt蛋白被认为是由膜受体卷曲蛋白(Fz)和低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(LRP5/6)家族成员组成的细胞表面受体复合物的配体。在FzLRP5/6复合物的下游，典型的Wnt信号将β-catenin稳定和易位到细胞核，从而与T细胞因子/淋巴样增强因子(TCF)/Lef转录因子结合。β-catenin-TCF/Lef复合物能激活多种Wnt反应基因的转录，包括参与细胞增殖、成骨细胞分化和成骨基因表达等[26]。德雷可夫斯基等发现Notch-1过度表达是通过抑制Wnt/β-catenin信号通路而不是BMPs信号来抑制成骨细胞发生，还有学者发现，酒精不仅抑制成熟的成骨细胞活性，还能抑制Wnt信号通路以及β-catenin蛋白的表达，表明酒精可通过刺激氧化应激抑制Wnt信号从而抑制骨形成[27]。有研究发现，CCN1/Cyr61的表达可能在Wnt3A诱导的间充质干细胞成骨分化中起重要作用，Wnt10b是人类和小鼠唯一与间充质祖细胞功能相关的Wnt配体，也是维持成人骨间充质干细胞活性所必须的信号[28]。还有一些研究表明，非典型Wnt信号也可能在成骨分化中发挥作用。例如涉及Ror2和RhoA的非经典Wnt5a信号以及N-cadherin介导的β-catenin信号是机械诱导成骨分化所必需的，而Wnt-4可能在改善骨再生和修复颅面缺损方面具有潜在的应用价值。Wnt5a可以诱导成骨分化，抑制PPAR-γ在Adscs中的表达，这一途径激活β-catenin-T细胞因子/淋巴样增强因子(TC F)/Lef转录因子(Lef)，进一步增强成骨[29]。

3.4Notch信号通路 典型的Notch信号当细胞表面表达的Delta/Serate/LAG-2(DSL)配体与在相邻细胞表面表达的Notch受体(Notch-1、-2、-3和-4)结合时启动。Notch信号在干细胞或是祖细胞的发育、再生以及控制其命运中起着重要作用。人们普遍认为，Notch系统较为保守的平衡了干细胞或祖细胞的增殖和分化。以往的研究表明，Notch信号对ST-2骨髓基质细胞、小鼠骨髓间充质祖细胞、成骨细胞M3T3-E1、间充质祖细胞Kusa、C2C12成肌细胞和COS-7细胞等多种细胞的成骨分化有正调控作用[30]。当腺病毒载体将Notch1胞内结构域(NICD)转染到成骨细胞MC3T3E1细胞时，在长期培养中观察到钙化结节的形成明显增加。在原代人骨髓间充质干细胞的培养中也观察到类似的效果。当用含有人N1ICD或其配体Jagged1的腺病毒载体转染到人骨髓间充质干细胞时，培养物表现出钙化作用。然而，当显性负性mastermind1蛋白与N1ICD或Jagged1共表达来抑制Notch信号时，细胞成骨分化的过程则会被部分延迟[31]。虽然Notch被证实在骨骼发育及修复中起着重要作用，但通过Notch信号诱导脂肪干细胞成骨分化方面的研究仍较少，这可能是未来开发新的骨组织再生及修复途径之一。

3.5成纤维细胞生长因子(FGF) 由于没有发现Adscs的特异性标记物，所以很难确定影响Adscs在体内自我更新的因素。FGF在体外Adscs培养过程中对Adscs的自我更新起着重要作用。Zaragosi等报道，Adscs倍增时间的延长与MSCs中FGF2表达的减少有关[32]。Adscs不表达FGF1，而表达FGFR1，这表明Adscs可能与FGF2更为亲和。在20个传代过程中，FGF2的加入增加了Adscs的增殖。与骨髓来源的MSCs相比，FGF2在Adscs中的表达更高，并通过增加初始增殖率促进Adscs的成脂和成骨分化[33]。

4 Adscs在颅骨缺损修复中的作用

目前骨组织工程在颅骨缺损修复中的一大难题是如何改善工程骨在体内的血运。体内Adscs处于低氧环境中，使其成为基于细胞治疗的良好候选者，在植入后缺乏血液供应时，氧供应可能受到限制，导致工程骨植入后骨形成不良等问题。课题组之前的研究表明，低氧预适应/远隔缺血预适应可通过促进海马神经元再生，或分泌外泌体来提升神经细胞的低氧耐受能力。本研究结果表明，Adscs经历低氧后成骨性基因蛋白质表达有增高趋势，因此通过低氧预适应处理介导Adscs成骨也是一个具有前景的研究方向。Adscs能分泌血管生成细胞因子，如肝细胞生长因子和血管内皮生长因子，这些细胞因子被认为是Adscs血管生成特性[34]。通过移植Adscs产生的细胞因子和趋化因子，也可作为内源性干细胞和祖细胞向损伤部位集结的信号。因此，Adscs的存在不仅可以促进成骨分化，也可以促进血管生成。

虽然Adscs已被证明可以用于修复颅骨缺损，但许多国家尚未批准用于临床，目前临床使用案例较少。Thesleff等利用脂肪干细胞结合β-磷酸三钙颗粒治疗两名颅骨缺损的患者，术后随访期间无临床并发症，并且复查头颅CT也显示令人满意的骨化结果[35]。Sándor等用Adscs与Bmp2和β-磷酸三钙颗粒结合治疗1例因为肿瘤切除而导致下颌骨大面积缺损的患者，成功进行颌骨重建[36]。Adscs也可应用于微血管重建，kmesim等报道1例采用Adscs、Bmp2以及β-磷酸三钙颗粒用于修复上颌骨缺损的病例，在手术重建4个月后，生成成熟的骨组织以及血管结构。Stefan等报道运用Adscs、自体纤维蛋白胶以及支架联合治疗1例颅脑重度损伤合并颅骨大面积缺损的7岁小孩，术后病情平稳，重建3个月后CT显示新骨形成，颅骨连续性较为完整[37]。

5 总结

综上所述，干细胞被定义为生物系统的组织单位，负责器官、组织的发育和再生，是先进组织工程和细胞治疗中不可或缺的工具。成人干细胞可以自体取材并应用于自身。对于组织工程而言，成人干细胞可以播种在合成或自然衍生的支架上，并通过适当的支架组成、结构、力学性能和物理化学性质的组合，以及适当的细胞培养基、适当的机械或电磁刺激来分化为所需的表型。对于细胞治疗而言，干细胞以自分泌方式产生的生物活性分子，特别是生长因子和免疫调节分子可以直接应用于受损组织。在成人干细胞中，脂肪组织干细胞被认为是最有前景的细胞类型，因为其Adscs分离简单、相对安全。而脂肪组织被认为是Adscs最方便和最丰富的来源，具有易于获取和较少的伦理复杂性，使Adscs成为再生治疗方法中最合适的干细胞来源。同时Adscs在适宜的刺激因素下可以进行成骨分化，从而修复骨缺损，因此Adscs在治疗颅骨包括颅面骨的缺损方面是可行的，并且这方面的临床研究以及实验正在不断取得进展。但由于Adscs目前缺乏一个统一高效的培养方法，并且Adscs等其他干细胞所产生的生长因子、细胞因子、免疫抑制因子和其他生物活性分子可能对肿瘤转移及生长存在一定支持作用，所以仍存在较大挑战。随着Adscs鉴定、分离、培养以及定向诱导其分化的方法不断发展，可为未来临床颅骨缺损修复提供效果非常好的治疗途径。