鸡传染性喉气管炎实验室诊断技术

2021-12-03张雪梅刘春青

中国畜禽种业 2021年7期

张雪梅刘春青

(1，山东省济南市动物疫病预防与控制中心 250109；2，山东省济南市畜牧技术推广站 250306）

鸡传染性喉气管炎（ILT）是一种严重危害养禽业的重要呼吸道疾病，该病的病原是传染性喉气管炎病毒（ILTV）。我国自20 世纪50 年代发现本病，此后在多省份呈现流行性，给养禽业带来了巨大的经济损失，本病及时确诊并采取相应的防控手段成为减少经济损失的关键。对于鸡群是否感染ILTV，根据临床症状、剖检变化及流行病学特征可以做出初步诊断，但由于该病的临床症状和剖检变化与新城疫、传染性支气管炎、禽流感、传染性鼻炎和支原体病等呼吸道疾病有许多相似之处，易在临床诊断过程中发生混淆，因此，实验室诊断是确诊鸡传染性喉气管炎必需的。实验室诊断ILTV 有多种方法，主要包括病毒分离、血清学检测技术和分子检测技术。

1 病毒分离鉴定

病毒分离是最敏感的病原学鉴定方法，通过将病毒接种到9～12 日龄的鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）上进行分离。样品可以是疑似感染鸡的口咽、气管拭子或病死鸡的喉头、气管和肺部等样品。将处理后的样品接种到CAM 上，感染后48h 可以观察到痘斑，不同毒株在CAM 形成的痘斑大小和形态不同，2～12d鸡胚就会死亡，再利用ILT 标准阳性血清和标准阴性血清与分离物做鸡胚中和试验，当阴性血清组和阳性血清组的EID50 的对数之差大于或等于2.5 时可判定为ILTV[1]。病毒分离鉴定的方法步骤烦琐，所需时间较长，且需要大量鸡胚进行试验，已不能满足快速检测的需要。但目前ILTV 的分离主要还是通过将病料接种到鸡胚CAM 和原代细胞的方法进行分离，同时鸡胚还是繁殖ILTV 最常用的方法。

2 血清学检测技术

血清学检测技术依靠抗原抗体的特异性结合，对样品中的抗原或抗体进行定性或定量的检测技术。

2.1 琼脂凝胶免疫扩散试验

标准的琼脂凝胶免疫扩散试验使用抗原和标准阳性血清检测样品中的ILTV 抗体，具有操作简便、快速等特点，能将ILT与鸡痘、新城疫区分开来。琼脂凝胶免疫扩散试验是早期实验室诊断ILT 的常用手段，但这种方法普遍敏感性较低，且由于性能不稳定，目前已无相应产品供应。

2.2 血清中和试验

经典的中和试验是将抗血清与待检病毒充分混合，在37℃温箱中作用1h 后接种8～12 日龄的鸡胚或细胞培养物，以正常血清加待检病毒作为对照组，若抗血清能中和病毒，则判定为ILTV感染。中和试验经济方便，但某些弱毒株并不能被目前的标准强度抗血清中和，目前中和试验已较少出现在常规实验室诊断中。

2.3 酶联免疫吸附试验

普通ELISA、间接ELISA、抗原捕获ELISA 等方法都用来诊断ILT，实验证明，ELSA 方法比病毒分离、琼脂凝胶免疫扩散试验和中和试验更加敏感、快速和准确。现在已有商业ELISA 试剂盒利用抗体检测方法诊断ILT，具有较好的敏感性、特异性和重复性。

3 分子检测技术

ILT 的分子检测方法近年来得到迅速发展，DNA 分子检测技术可以快速、准确的鉴别ILTV，且灵敏度很高，包括传统的聚合酶链反应(PCR)、实时荧光定量PCR 及环介导等温扩增技术（LAMP）等。利用分子检测技术检测ILTV 比病毒分离和血清学检测方法更加敏感，而且能在样本存在其他病原体污染的情况下鉴定出ILTV。

3.1 PCR 技术

目前，大部分兽医实验室已经建立起PCR 检测方法，应用PCR 技术检测ILTV 操作简单、用时较少，且灵敏度高、特异性强，对样品要求不严格，还能在潜伏感染阶段检测出病毒，是目前使用最广泛的实验室诊断手段。应用PCR 技术检测ILTV 的DNA，引物序列的选取至关重要，一般以gB 基因、TK基因的一部分为参考序列，也有选取gC 基因、UL15、ICP4 等保守序列。

3.2 荧光定量PCR 技术

TaqMan 荧光定量PCR 和SYBR Green 荧光染料PCR 都已经被用来检测ILTV，荧光定量PCR 技术的灵敏度高，最低能检测到100 拷贝的病毒，且能定量分析临床样本中ILTV 的含量，对量化区分ILTV 在鸡体不同组织的分布模式，测定不同时间感染鸡群ILTV 含量有重要意义[2]。

3.3 环介导等温扩增技术(LAMP)

LAMP 最先在2000 年被发明，目前也已被用于实验室检测ILTV[3]。相较于其他分子检测技术，利用LAMP 检测ILTV 灵敏度高，特异性强、反应时间短，仅需要水浴锅或恒温箱，操作简单，可通过肉眼观察或浊度仪对结果进行分析，但引物设计和筛选难度大，需要针对靶基因的6 个区域设计4 条特异性引物，且易出现假阳性等。