家蚕Toll受体的研究进展

杨伟锋 陈雪晴 林泳仪 梁业彬 刘吉升

（广州大学生命科学学院 广东广州 510006）

1 家蚕及其价值

家蚕（Bombyx mori），又名桑蚕，属于鳞翅目蚕蛾科，具有28 对染色体，起源于中国，由古代的原始野蚕驯化所获得，距今已超过五千年。在2004年，全国丝绸工业年产总值就达到了1 385.35 亿元，茧丝的产量占全球总额的70%，出口量占全球总额的80%，年创汇达40 亿美元[1-2]。家蚕作为我国历史悠久的经济昆虫，不仅具有能够为纺织原料提供蚕丝这一经济价值，同时也是鳞翅目昆虫中的模式生物，有着良好的基础研究积累，并保存有大量的突变体。在2004年，我国西南大学家蚕基因组研究团队率先绘制出了家蚕基因组框架图，建立了世界上最大的家蚕表达序列标签数据库，发现了与家蚕发育和变态、性别的决定、激素调节及免疫等密切相关的关键功能基因群[3]。在2009年，该团队完成了对家蚕基因组精细图谱的绘制，超过13 000 个基因被定位于家蚕染色体上[4]。同时还对29 个家蚕突变品系和11 个中国不同地理来源的野桑蚕进行了全基因组测序与序列比较分析，从基因组水平方面揭示了家蚕的起源进化[5]。家蚕是鳞翅目中第一个完成全基因组测序的昆虫，是鳞翅目的模式生物，具有重要的科研价值。

2 昆虫免疫

昆虫虽然有着非常出色的机体物理屏障，如角质表皮或甲壳能够保护机体免受外源体入侵，但昆虫与哺乳动物不同，并不具有高度专一的特异性免疫，其免疫系统仅拥有的非特异性免疫成为保护机体免受病原微生物入侵的重要保障。昆虫具有强力高效的非特异性免疫系统，能够鉴别并消除入侵的病原体和寄生虫[6-7]。该系统针对微生物入侵感染做出的免疫反应包括细胞免疫（cellular immunity）和体液免疫（humoral immunity），这两个免疫反应间具有紧密的联系。在面对外来病原体入侵时，无论细胞免疫或者体液免疫都会首先通过模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）进行识别，这些模式识别受体可以特异性地识别外来病原体上的病原相关分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs）。细胞免疫反应中包括吞噬作用和包被反应，随着体内血细胞的循环进行调节，而由昆虫脂肪体合成和分泌抗菌肽而形成的体液免疫比细胞免疫更快更早地产生防御应答[8]。昆虫具有复杂的抗菌肽基因表达调控机制，不同种类的抗菌肽能够特异性地激活特定基因的表达，当抗菌肽结合到细菌或真菌表面时，能够引起菌体的裂解和死亡[9]。抗菌肽的合成由两条不同的信号通道调节，分别是Toll 信号通路和IMD （immune deficiency）信号通路，它们介导合成不同的抗菌肽。其中，Toll 信号通路不仅能够介导机体对入侵的病原真菌和革兰氏阳性细菌的感染，快速地产生相应的抗菌肽[10]，同时它在细胞免疫应答中也起着关键的作用[11]。Toll 信号通路的激活包括细菌的识别、配体Späetzle 的活化、Toll 受体的结合与激活，以及对下游作用基因的转录，能够快速调节抗菌肽的合成及分泌[12]。

3 Toll 受体的结构与发现

Toll 受体是一类存在已久的受体蛋白，属于I 型跨膜糖蛋白，其胞外段富含亮氨酸重复序列（leucine-rich repeats，LRR），能够参与配体识别；胞内段含有保守的TIR 结构域（toll/interleukin-1 receptor domain），能够与下游分子如髓样分化因子88（myeloid differentiation factor88，MyD88）、TIR受体蛋白（toll/interleukin-l receptor domain adapter protein，TIRAP）、β 干扰素TIR 结构域衔接蛋白（TIR-domaincontaining adaptor inducing interferon-β，TRIF）、TRIF 相关接头分子（trif-related adaptor molecule，TRAM）进行信号转导，并激活Späetzle 蛋白[13]。Toll 受体是在1980年研究黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）胚胎发育的过程中被首次发现的一种蛋白[14]，最初发现Toll 受体时，人们认为这是一类与发育相关功能的蛋白，而后续研究发现Toll 受体可以识别并激发出免疫和炎症反应以破坏入侵机体的病原微生物，普遍存在于无脊椎动物和脊椎动物等真核生物中，在无脊椎动物的非特异性免疫和脊椎动物的特异性免疫中起重要作用。1988年，Toll受体被发现是一类跨膜蛋白质，同时也研究了其蛋白的结构[15]。1991年，发现该蛋白细胞外亮氨酸富集重复序列（leucine-rich repeats，LRR）与哺乳动物细胞内Toll-白介素1 受体（interleukin-1 receptor，IL-1R）具有同源性，二者的细胞质部分相似[16]，该研究提示了Toll 受体可能与免疫有关。1994年，Nomura 等人首先报道了人类中的Toll 受体[17]，然而当时Toll 受体的免疫学功能并没有被发现，所以人们仍然认为Toll 受体参与了哺乳动物发育的相关调节。1996年，Toll 受体的研究结果发现其在果蝇的非特异性免疫起着重要作用，对不同的微生物如真菌、细菌等能够诱发相应的免疫效应，从而确立了Toll 受体的免疫学意义[18]。

Toll 受体于昆虫的非特异性免疫中就如同一个监视器，能够监视和识别各种不同的病原相关分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs），在昆虫抵御外源入侵机体中起着重要作用[19]。昆虫Toll 受体的分布会因物种、受体的亚型、发育时期及所处环境条件的不同而有所差异[10]。自1980年在研究果蝇胚胎发育时，首次发现了Toll 受体在果蝇胚胎背腹轴分化形成中起着重要的作用[14]，目前，在果蝇中已经发现存在有9 种Toll 受体，依次命名为Toll、Toll2～Toll9。其中果蝇Toll 受体除了在胚胎发育中起着关键作用外，同时在非特异性免疫中也具有明确的功能，能够对革兰氏阳性细菌和真菌病原体响应[20]。Toll 和Toll7 受体能够结合多个Späetzle 蛋白并激活抗菌肽基因的转录[21]。另外在蜜蜂（Apis mellifera）中已经发现存在有5 种Toll 受体，在甲虫中发现9 种Toll 受体[22]，在冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）发现 11 种 Toll 受体[23]，同时在烟草天蛾（Manduca sexta）、埃及伊蚊（Aedes aegypti）、豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）等昆虫中都发现了不同的Toll 受体；而在家蚕（Bombyx mori）中已鉴定出14 个Toll 相关的基因[22,24]。

4 家蚕Toll 受体的功能研究

2002年家蚕首个Toll 基因被克隆出来[25]，近年来在家蚕中鉴定出14 个Toll 相关的受体，分别命名为BmToll3、BmToll6、BmToll7、BmToll8、BmToll9、BmToll10 和BmToll12，其中BmToll3 受体中包含BmToll3-1、BmToll3-2 及BmToll3-3 受体，BmToll7 中同样包含BmToll7-1、BmToll7-2 和BmToll7-3 受体，而BmToll9 受体又存在着BmToll9-1 受体与BmToll9-2 受体，BmToll10 受体中存在着BmToll10 -1、BmToll10 -2 及BmToll10 -3[24]。家蚕的Toll受体分布在不同的染色体中，BmToll9 定位在3 号染色体上，BmToll7-3 定位在6 号染色体上，BmToll3-1定位在12号染色体上，BmToll3-2 和BmToll3-3 定位在14 号染色体上，其余8 个家蚕Toll 受体基因在23 号染色体上形成串联重复群。而针对家蚕的Toll 相关受体的系统进化树分析得出，BmToll7 的3 个受体具有更近的进化关系，而BmToll3-2 和BmToll3-3 具有同一祖先，BmToll10 -1 和BmToll12 具有较近的进化关系。大部分Toll 受体都在进化树上处于接近的位置，而唯有BmToll9 是个例外，与其他Toll 受体的进化距离都较远[22]。家蚕Toll 基因的时空表达谱表明BmToll7-2、BmToll7-3 和BmToll3-3 在卵巢和中肠都富集表达，BmToll10 -1、BmToll10 -2 和BmToll10 -3 在精巢特异表达，表明这些Toll 基因可能与性别特异性的生物学功能相关。BmToll9-1 主要在中肠中表达[26]，BmToll9-2 基因在家蚕幼虫不同龄期中不同组织的表达各异，其中4 龄期在脂肪体、马氏管、神经和丝腺中表达较明显，而5 龄期则在脂肪体、中肠、马氏管和神经中表达较为明显[27]。

目前研究表明，家蚕Toll 信号通路能够被大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和白僵菌（Beauveria）诱导激活[28-29]。而家蚕Toll基因在不同的外源入侵物的感染实验发现，BmToll7-2 在被脂多糖诱导后，大部分组织的表达量均下调[25]，BmToll7-3在被真菌和大肠杆菌诱导下表达量也下调，而BmToll3-2、BmToll3-3、BmToll10 -2 和BmToll10 -3 则在真菌和大肠杆菌诱导下表达量显著上调，表明这类基因可能参与了家蚕的免疫调节过程，而BmToll7-2 和BmToll3-3 则在大肠杆菌诱导下表达量明显下调[22]。对家蚕幼虫进行白僵菌感染实验发现，不同的Toll 受体在家蚕受到白僵菌感染后的表达模式也存在显著的差异，BmToll3-2、BmToll6、BmToll7-1 和BmToll9 基因在不同的注射时间显著上调，而BmToll10 -2与BmToll10 -3 基因则出现下调现象[28]。目前针对家蚕Toll9受体的研究报道较为详细，已发现对家蚕幼虫注射双链RNA 和脂多糖后，能明显抑制BmToll9-1 基因在中肠中表达，且BmToll9-1 受体也被鉴定为具有先天性免疫以及调节RNA 干扰机制基因表达的功能[30]。而当家蚕被大肠杆菌和白僵菌感染后，其肠道中BmToll9-1基因的表达水平显著提高[26]。关于家蚕BmToll9-2 基因的研究表明，对家蚕4 龄和5 龄幼虫注射脂多糖和大肠杆菌可诱导BmToll9-2 基因的表达[27]。对家蚕5 龄幼虫注射肽聚糖和金黄色葡萄球菌能使BmToll9-2 基因表达上调[31]，推测家蚕Toll9 受体在受到外源入侵。由此可以看出，并非所有家蚕Toll受体在受到外源入侵时都做出相同的响应，不同的Toll受体在受到不同的外源物入侵时存在着明显的表达差异，这可能是由于家蚕不同的Toll 受体在免疫通路上发挥着不同的作用或识别的受体不同所导致的，然而每种Toll受体的具体功能仍需进一步探究。

5 小结

家蚕是我国历史悠久的经济昆虫，同时也是鳞翅目昆虫中的模式生物。近年来我国桑蚕业的发展面临着巨大的压力，本土桑蚕病害对蚕茧质量的影响较大，2014年中国丝绸商品出口总额仅为 30.79 亿美元，同比下降了12.19%[32]，随后几年出口总额整体呈下降趋势，到2019年中国丝绸商品出口额为21.69 亿美元，比2018年出口额29.58 亿美元同比下滑了26.66%[33]。因此，提高家蚕对病害的抵抗力不仅对桑蚕相关产业经济具有重要意义，更有利于我国实现蚕丝业的可持续发展。

Toll 受体作为免疫通路上的重要成员，具有配体识别并产生免疫和炎症反应以破坏入侵机体的病原微生物的功能。Toll 受体在Toll 信号传导的过程中起着连接细胞内外的作用，其中涉及各种不同的信号转导因子[34]，而不同的信号转导因子在家蚕免疫过程中可能存在不同的调节模式[28]。Toll 信号通路中存在着复杂的调控机制，而Toll 受体在其中发挥的具体作用仍需进一步探究。近年来关于家蚕Toll 受体的研究主要是通过分析其时空表达谱，以及对各种外源病原体的入侵进行探究，然而并没有得到确切的功能相关报道。而从果蝇的相关报道中发现，其Toll 受体除了在胚胎发育中起着关键作用外，同时在非特异性免疫中也具有明确的功能，能够对革兰氏阳性细菌和真菌病原体响应[20]。果蝇Toll9 受体也在2001年被鉴定出能够对真菌产生免疫反应[35]，而在2011年有研究表明对果蝇的Toll9 受体进行缺失突变改造后，果蝇胚胎的致死率增高，果蝇发育成虫出现延迟以及寿命缩短的现象。因此，关于家蚕Toll 受体的相关功能，仍需进一步深入研究，明确家蚕Toll 信号通路具体的分子机制，对家蚕的免疫乃至防治桑蚕病害具有一定的意义。