苦木注射液成分抑制SARS-CoV-2的研究*

赵广健， 翟德设， 于日磊,2,3， 李以诺， 李 俪,2,3， 徐锡明,2,3， 初燕燕,2,3**

(1．中国海洋大学医药学院，山东 青岛 266003； 2．青岛海洋科学与技术试点国家实验室，山东 青岛 266237；3．青岛海洋生物医药研究院，山东 青岛 266100； 4．广东万年青制药有限公司，广东 汕头 515064)

冠状病毒(Coronavirus)是有包膜的线形正义单链 RNA病毒，可引起多种动物的多系统感染，引起呼吸道、肠道、心血管及神经系统疾病等。2019年12月，一种感染人类的新型冠状病毒肆虐中国乃至全世界，目前认为其主要传播途径为飞沫传播，国际病毒分类委员会将其命名为SARS-CoV-2，世界卫生组织(WHO)将SARS-CoV-2引起严重的严重急性呼吸性肺炎命名为“COVID-19”(Corona Virus Disease 2019)[1]，感染者早期表现为急性呼吸道感染症状，一些迅速发展为急性呼吸窘迫综合征、急性呼吸衰竭等。SARS-CoV-2较2002年的SARS冠状病毒具有潜伏期长、传播速度更快、传染性更强的特点[2]。

在感染过程中，冠状病毒结构蛋白中的棘突蛋白(Spike蛋白)参与病毒和宿主细胞融合，宿主细胞蛋白酶可以将其分裂为S1和S2亚基，S1含有一个保守的受体结合域(RBD)，可与宿主细胞上的血管紧张素转化酶2 (ACE2)结合，S2具有与细胞膜融合的活性[3-5]。SARS-CoV-2的棘突蛋白具有更加特异性的弗林蛋白酶(furin)裂解位点，这可能是其传染力更强的原因之一[3]。病毒融合后，其复制主要由病毒的主要蛋白酶(Mpro，也称3CLpro蛋白)控制[6-7]。病毒的另一个蛋白酶—木瓜样蛋白酶(PLpro)，也在病毒复制中起关键作用，并可稳定病毒和细胞的结合[8]，帮助冠状病毒逃避宿主的先天免疫反应[9]。冠状病毒具有复杂的非结构蛋白(nsp1-16)结构，如RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)，RdRp以单链RNA为模板合成互补RNA链，在病毒基因组复制和转录中起到了必不可少的作用[10]；nsp3具有二磷酸腺苷-核糖-1”-单磷酸酶(ADP-ribose-1″ -mono-phosphatase, ADRP)结构域(亦称X结构域)，该结构域是冠状病毒特有的，并且介导ADRP活性的活性位点和底物结合区在序列上具有高度保守性[11]；nsp16是一个甲基转移酶，可使mRNA甲基化来增加病毒mRNA在宿主细胞内的稳定性，对于病毒蛋白的翻译至关重要。研究表明，一些病毒的nsp16，如流行性腹泻病毒，还有降低人体免疫力，促进病毒增殖的作用[12]。无论是与病毒融合相关的棘突蛋白和ACE2受体，还是与病毒复制和转录相关的Mpro、Plpro、RdRp、X结构域和nsp16均是抗SARS-CoV-2的重要靶点。为了快速寻找抗SARS-CoV-2药物，传统中药成为药物研发工作者们的焦点。

苦木为常用中药材，首载于《中国药典》1977年版(除1985年版未收载外)，历版药典均有收载。苦木性寒昧苦，归肺、大肠经，具有清热祛湿、解毒消肿的功效，用于治疗风热感冒、咽喉肿痛等。苦木的药用部位为苦木科植物苦木(PicrasmaquassioidesBennet)的干燥枝叶，其主要化学成分为生物碱，β-咔巴啉类和铁屎米酮类，还有苦木内酯(苦味素)类、三萜和黄酮类等。药理学研究表明萜类化合物具有抗HIV病毒活[13-14]，苦木内酯类具有抗肿瘤[15-17]、抗炎[18-19]、抗寄生虫[20]、抗病毒[21]等活性。苦木的抗炎、抗病毒作用在临床上已有广泛应用，如苦木注射液被用于感冒、上呼吸道感染，疗效确切，安全性高[22-23]。

为了寻找有效的抗新型冠状病毒药物，本文收集了广东万年青制药有限公司提供的苦木注射液(上市批准号：国药准字Z44021192)的主要化合物组分，并通过计算机模拟探索了各主要成分与新型冠状病毒7个靶点的相互作用，模拟结果发现有5个化合物具有较好的抗SARS-CoV-2靶点的能力，或可用于进一步开发为抗SARS-CoV-2药物。

1 实验方法

1.1 化合物的准备

根据广东万年青制药有限公司提供的化合物结构(见图1)，采用Schrödinger2019软件包的ligprep模块将小分子化合物转化为三维结构。在OPLS3力场下，为小分子化合物加上氢和电荷，用Epik软件预测化合物在pH为7.0时的质子化状态。

1.2 靶点的准备

从青岛海洋科学与技术试点国家实验室的2019-nCoV药物靶标结构信息共享平台(http://ncovtarget.qnlm.ac/web/mg/hm)中下载相应靶点的结构，靶点分子的预处理则用Protein Preparation Wizard进行。为靶标分子加上氢和电荷后，删除不必要的水分子，氨基酸的质子化状态用PROPKA软件预测。在OPLS3力场下，对蛋白结构进行能量优化。

1.3 分子对接与自由能计算

用Glide软件进行分子对接，对接过程选用标准精度(SP)，每个小分子最终保留3个优势构象用于结合自由能计算。靶标与小分子的结合自由能用Prime的MMGBSA方法进行计算，计算过程中设定结合口袋周围4 Å范围内的氨基酸为柔性。

2 结果与讨论

2.1 化合物的准备

本次收集到苦木化合物28个，结构主要为β-咔巴啉类和铁屎米酮类(见图1)。对于手性不明确的化合物，我们考虑了其所有可能的手性状态，共计生成41个化合物三维结构。

图1 苦木注射液的主要化合物成分

2.2 对接结果打分和结合自由能

通过Glide软件将化合物分别对接到7个抗冠状病毒靶点的结合口袋中。考虑到蛋白质的柔性，计算各化合物与靶点的结合自由能时，使结合口袋周围4 Å内的氨基酸侧链为柔性。由于RdRp为金属蛋白，化合物与RdRp的结合主要为配位相互作用，而结合自由能主要考虑的是非键相互作用，因此，本研究中没有计算RdRp与化合物的结合自由能。对接结果表明，所研究的化合物均不能与Spike蛋白较好的结合，对接打分(S)值普遍高(>-4)，因此，本研究没有计算该靶点与化合物的结合自由能(ΔG, kcal/mol)。通过该研究，我们发现了5个苦木组分KM-5、KM-16、KM-17、KM-19和KM-27具有结合Mpro、PLpro、X结构域以及ACE2中的一个或多个靶点的作用，并没有发现与RdRp、Spike蛋白和nsp16结合较好的组分(见表1)。同时用MolAICal (https://molaical.github.io/)预测了化合物PAINS，结果表明所有化合物均没有PAINS问题。

从表1可以看出，KM-27和KM-5具有强X结构域结合能力，其对接打分分别为-7.94和-7.01，结合自由能分别为-64.67和-51.93。KM-16和KM-17也可以与X结构域结合，其结合自由能分别为-44.38和-45.96，较KM-27的结合强度要弱很多。KM-27与X结构域的结合是所有化合物中最强的，母核上的酚羟基作为氢键受体和SER156的主链氨基上的氢形成一条氢键，同时作为氢键供体和ASN155的支链羰基形成一条氢键，母核上的醇羟基和LEU125形成一条氢键，支链上的酚羟基作为氢键受体和ASN155形成一条氢键，作为氢键供体和ASP21形成一条氢键，支链上的甲氧基作为氢键受体和ALA22形成一条氢键；母核与支链分别与PRO124、ILE48存在疏水作用(见图2(A))。KM-5在X结构域的结合位点与KM-27的不同，KM-5主要通过羧基与ALA49、GLY45的主链氨基形成氢键，KM-5还通过两个甲氧基和酚羟基作为氢键受体与SER127、GLY129和ILE130的主链氨基形成氢键，脂肪链上的羟基作为氢键受体ASN39的支链氨基形成一条氢键；芳香环与ALA37、ILE130和PHE131形成疏水相互作用。这些有利的相互作用使KM-5可以与X结构域紧密结合。

表1 苦木注射液中化合物的分子对接和结合自由能计算结果

(蓝色实线代表氢键，灰色虚线表示疏水相互作用。The blue solid lines represent hydrogen bonds, the gray dotted lines represent hydrophobic interactions．)

除了结合X结构域，KM-27还表现出最强的Mpro和PLpro结合作用，其结合自由能分别为-51.17和-49.53，并对ACE2有弱结合能力。KM-16、KM-17和KM-19也具有良好的PLpro结合能力，结合自由能分别为-44.61、-43.25和-45.97。其中KM-17和KM-19对Mpro有良好的结合能力，结合自由能分别为 -48.11和-42.84。KM-27对多靶点均表现出优异的结合能力可能是源于其具有3个手性中心，具有更大的化学空间。分别选取KM-27与Mpro和PLpro结合最佳的消旋体化合物进行结合模式分析，发现KM-27与Mpro和PLpro均具有较好的相互作用。母核上的酚羟基作为氢键受体与供体与Mpro的GLU166主链氨基与羰基分别形成一条氢键；母核上的两个醇羟基作为氢键受体分别与HIS41、TYR54形成一条氢键；支链上的酚羟基作为氢键供体和LEU141形成一条氢键，作为氢键受体和SER144形成一条氢键；支链上的甲氧基作为氢键受体和GLY143主链氨基形成氢键作用；母核芳香环与MET165、GLN189产生疏水作用(见图3(A))。KM-27母核上的一个醇羟基作为氢键受体与PLpro的ASP165、ARG167分别形成一条氢键，另一个酚羟基作为氢键受体与TYR274形成氢键，与ALA247形成水桥；支链上的甲氧基作为氢键受体与GLN270支链上的氨基形成氢键作用；母核芳香环与TYR269形成π-π相互作用，与TYR265、PRO249存在疏水作用；支链芳香环与TYR269、TYR265存在疏水作用；母核上的酚羟基与ASN268、TYR269形成水桥(见图3(B))。

(蓝色实线代表氢键，灰色虚线表示疏水相互作用，绿色虚线表示π-π相互作用，白色小球表示芳香环的中心或水桥的桥原子，白色实线表示水桥。The blue solid lines represent hydrogen bonds, the gray dotted lines represent hydrophobic interactions, the green dotted line represents π-π interaction, and the white balls represent the center of aromatic rings or bridge atoms of the water bridges, and solid white lines represent the water bridges.)

KM-19除了与Mpro和PLpro结合外，可能与ACE2具有较好的结合，其结合自由能为-47.79。KM-19与ACE2的结合模式显示，KM-19的并环与PHE274形成了良好的π-π相互作用，与THR445存在疏水作用，环外羰基作为氢键受体与ARG518形成一条氢键，羟基作为氢键受体和供体与ARG273形成两条氢键作用(见图4)。

(蓝色实线代表氢键，灰色虚线表示疏水相互作用，绿色虚线表示π-π相互作用，白色小球表示芳香环的中心。The blue solid lines represent hydrogen bonds, the gray dotted line represents hydrophobic interactions, the green dotted lines represent π-π interactions, and the white balls represent the center of aromatic rings.)

4 结语

鉴于2019-CoV肆虐，苦木注射液是一种有效的抗流感病毒药物，本研究旨在探讨苦木注射液是否具有抗冠状病毒的作用。我们寻找了28种苦木注射液中的化合物，通过分子对接和结合自由能计算，发现5个化学组分可以靶向抗冠状病毒靶点Mpro、PLpro、X结构域和ACE2中的一个或多个。筛选结果表明苦木注射液具有一定的抗冠状病毒作用，这5个化学组分或可进一步研究或开发为抗新型冠状病毒药物。